癌症治疗中mRNA前体剪接的小分子调节剂外文翻译资料

癌症治疗中mRNA前体剪接的小分子调节剂

原文作者：Maayan Salton^1,2和 Tom Misteli¹

单位：1美国国家癌症研究所,马里兰州20892

2以色列希伯来大学哈达萨医学院生物化学与分子生物学系，耶路撒冷91120

摘要：mRNA前体剪接是哺乳动物基因表达的基本过程，选择性RNA剪接对蛋白质多样性的产生起着重要作用。RNA剪接事件是包括癌症在内的许多疾病的病理关键。一些肿瘤在分子上依赖于特定的 RNA 剪接异构体，这使得干扰 mRNA前体加工成为一种可行的治疗策略。几种RNA剪接调节剂已被鉴定，显示出在临床前研究中的前景。虽然大多数剪接调节剂的靶标都是结构性RNA加工组件，具有不良的副作用，但已经观察到对单个剪接事件的选择性。鉴于剪接缺陷在癌症中的高发病率，RNA加工的小分子调节剂代表了癌症治疗的一种新的治疗策略。在这里，我们回顾了它们已被报道的作用、潜在的机制和局限性。

关键词：剪接调节剂； 癌症治疗；

RNA剪接导致癌症易发性

大多数人类基因都含有内含子，这些内含子在前体 mRNA 剪接过程中被移除^[1]。剪接反应由剪接体催化，剪接体是一种多亚基复合体，由非编码小 RNA（U1、U2、U4、U5 和 U6）和无数相关蛋白组成^[2]。剪接体协调去除内含子和连接相邻外显子所必需的两个酯交换反应。剪接体通过逐步形成识别调控序列并促进有效剪接的亚复合体来运作^[2]。

虽然许多外显子被组成性地剪接在一起，但选择性剪接(AS)是一个特定外显子被选择性地包括或排除的过程^[2]。AS具有很大的生理相关性，因为它能够通过组合使用剪接位点从单个前mRNA分子产生多种蛋白质异构体^[3，4]。除了蛋白质多样性外，AS还可以通过引入预成熟终止密码子导致细胞核中转录物的隔离和降解，从而减少mRNA的翻译；这些外显子通常被称为有毒外显子^[5，6]。

由于 RNA 剪接是哺乳动物细胞中的一个重要过程，剪接缺陷可能会影响细胞增殖的能力^[7]并且最近发现特定剪接同种型的产生是癌症的驱动因素^[8-12]。此外，癌症中剪接行为的整体改变可能是由可能决定致癌剪接模式的剪接因子表达的变化引起的^[13-16]，或者由产生具有促进癌症发展潜力的特定剪接同种型的突变引起^[12]。

RNA剪接参与促进肿瘤生长代表了一种可用于治疗目的的脆弱性。在异构体特异性癌症驱动因素的情况下，消除与癌症相关的剪接异构体可能会阻止致瘤性或转移。此外，癌细胞复制迅速，并且可能更广泛地使用剪接机制。因此，可以合理地假设这些细胞可能对其剪接机制的全局干扰敏感^[17]。

在这里，我们回顾了选择性剪接亚型不仅是癌症进展的旁观者而且可能是致癌驱动因素的癌症病例，我们强调了使用小分子剪接调节剂作为新兴治疗剂。我们将讨论重点放在特定剪接事件的调节上，不包括恢复全局剪接模式的方法，也不包括使用基于反义的剪接调控方法 ^[18]。我们强调了新发现，即许多已识别的剪接调节剂靶向组成型剪接成分，但会触发基因特异性剪接改变。它们作用的非特异性引发了这样一个问题，即它们的潜在副作用是它们在临床环境中应用的主要障碍。因此，要想取得成功，就需要完全了解他们的行动方式。

癌症中的剪接异构体

多年来，已经发现了许多驱动或促进癌症进展的剪接异构体的案例。最早的致癌AS事件之一是凋亡基因Bcl-x^[19]，它产生两种剪接异构体，一种是具有促凋亡特性的短形式(Bcl-xs)，另一种是具有抗凋亡作用的长形式(Bcl-xl)^[8](图1)。细胞凋亡是癌症的标志之一，正如预期的那样，高度细胞增殖的组织中，包括乳腺癌、结肠癌和肺癌在内的各种肿瘤都显示出高水平的Bcl-xL，导致凋亡潜能降低，从而提高癌症的细胞存活率^[8，20]。与Bcl-xl在促进肿瘤细胞增殖潜能中的关键作用一致，利用针对AS位点的反义寡核苷酸消除Bcl-xl可促进肝癌细胞的凋亡^[8]。BCL2家族的另一个成员，MCL1经历与Bcl-x类似的与癌症相关的过程，产生一个短的促凋亡异构体(MCL1S)^[21]和一个长的抗凋亡异构体(MCL1L)^[9](图1)。使用反义寡核苷酸降低MCL1L/1S比率会导致细胞死亡，从而削弱皮肤基底细胞癌的癌症进展^[22]。

其他与癌症相关的剪接模式更为复杂，例如肿瘤中的跨膜蛋白CD44。其前体 mRNA 包含 10 个相邻的外显子，这些外显子以组合方式包含在内以产生多种同种型。包括变体外显子 6 (CD44v6) 的 CD44 亚型在不同种类的癌症中富集，包括结肠癌、卵巢癌和头颈癌 ^[23-27]（图 1）。还发现 CD44v6 可作为结直肠癌干细胞的标志物，并且是转移性结直肠肿瘤迁移和产生所必需的^[10]。CD44v6 的促癌作用显而易见，因为靶向同种型可以阻止卵巢癌细胞的肿瘤细胞粘附和迁移^[28]。根据潜在的治疗应用，在一项 1 期临床试验中，针对 CD44v6 的抗体在人类头颈癌中显示出有希望的结果^[23]。据报道，S6K1 激酶的短同种型激活 mTOR 主要增殖途径会导致乳腺癌；乳腺癌细胞系和肿瘤具有高水平的 S6K1 短同种型并促进癌症进展^[29]（29）（图 1）。相比之下，长同种型的过度表达会阻止转化，其基因消融（敲除）会诱导肿瘤形成，表明它具有肿瘤抑制活性^[29]。

剪接异构体也有可能在全球范围内影响肿瘤行为。一个相关的例子是血管生成，这是癌症的一个突出标志，并且受 AS 的影响^[30]。VEGF 由需要氧气的细胞分泌，触发内皮细胞中的信号级联反应并引导它们生长形成血管，从而将营养和氧气输送到肿瘤^[25]。VEGF 中外显子 6a 的包含促进了 VEGF189 同种型的产生并减少了排除外显子 6a 的 VEGF165 的产生（图 1）。在缺氧后诱导低 VEGF165/VEGF189 比率以刺激血管生成^[30]。

剪接异构体也可能导致肿瘤类型的差异。含溴结构域的基因BRD4最初被描述为乳腺癌的抑癌基因^[31]。然而，随后对非实体瘤的研究揭示了淋巴瘤和白血病的原癌特性^[32]（图 1）。BRD4 的作用是高度组织特异性的，BRD4 的不同功能可能归因于产生两种不同的亚型，这两种亚型在癌症中似乎具有相反的功能。终止于外显子 11a 的短同种型的过度表达促进转移，终止于外显子 19 的长同种型的过度表达具有肿瘤抑制作用^[33]。人们很容易推测，促进 BRD4-L/BRD4-S 的高比例可能具有癌症保护作用。

虽然这些例子的癌症促进作用是由正常发生的剪接亚型的比例变化介导的，但致癌剪接亚型也可能由于致癌突变而出现。由突变引起的同种型成瘾癌症的一个主要例子是BRAF基因中的继发性内含子突变，导致黑色素瘤中产生缺乏外显子 4-8 的 BRAF3-9 同种型 ^{[12, 34]}（图 1）。BRAF中的错义突变 V600E是黑色素瘤的常见原因，在超过 50% 的患者中发现。该突变组成性激活 MAPK 通路并促进细胞增殖和癌症。BRAF(V600E) 是非常有效的 BRAF 抑制剂 vemurafenib 的靶点；然而，患者会迅速产生耐药性。耐药机制之一是产生 BRAF3-9 同种型的次级内含子突变^[12]。BRAF3-9 的产生赋予威罗非尼抗性并导致肿瘤生长。相反，减少 BRAF3-9 会减少耐药肿瘤的生长^[12]。

小分子剪接调节剂的发现

驱动或促进肿瘤生长的癌症特异性剪接异构体的存在使它们成为潜在的治疗靶点。虽然基于 RNAi 的方法和使用反义寡核苷酸是控制肿瘤中剪接异构体比率的明显方法，但在临床环境中提供 RNAi 和寡核苷酸的困难促使人们努力发现剪接的小分子调节剂（表 1）。

早期剪接调节剂被鉴定为 FR901464，其乙酰化衍生物剪接抑制素 A (SSA) ^[35-37]。 SSA 是一种从假单胞菌中提取的天然产物，首次被描述为对几种携带人和鼠肿瘤的异种移植模型具有抗肿瘤作用^[35-37]。后来才发现它结合并抑制剪接体成分 SF3B1 ^{[38, 39]}。通过这种方式，它会干扰 snRNA U2 与分支点的结合，使其不稳定，并阻止剪接体复合物 A 向 B 的转变 ^[38-40]。这一观察结果鼓励开发小分子剪接调节剂作为癌症治疗药物。

随后从不同的细菌菌株中提取了其他剪接调节剂，即来自Streptomyces platensis ^[41-44] 的 Pladienolides 和来自Streptomyces sp. 的GEX1 ^{[45, 46]}，并且两者都具有与 SSA ^{[47, 48]} 相同的作用机制。SF3B1 是从不同细菌菌株中提取的三种不同天然产物的目标，这一事实表明了一种共同的作用模式。最近，SSA、美亚霉素 B (MAMB) ^[49]和 Sudemycins ^[50]的合成类似物，以及 Pladienolide 类似物 E7107 ^[51]已经产生，并显示出与 SSA 具有相似的抗剪接特性（表 1）。同样，异银杏素是从M. glyptostroboides 的叶子中提取的一种天然成分，最初被描述为具有抗癌活性^[52]，后来发现它是前体 mRNA 剪接的抑制剂^[53]。

在各种高通量体外鉴定了其他小分子剪接抑制剂屏幕^{[54, 55]}。Madrasin 是从针对 71,504 个小分子文库的 PM5 前体 mRNA 剪接筛选^[56]中分离出来的，并且还显示抑制 HeLa 和 HEK293 细胞中内源基因的剪接^[57]。此外，使用荧光素酶剪接报告基因的高通量筛选确定克霉唑、氟桂利嗪和氯己定^{[46, 58]} 作为培养的 HeLa 细胞中的剪接调节剂。用三种化合物处理的细胞的微阵列分析显示，不同基因组的 AS 受到影响，表明每个基因的靶标特异性。氯己定的作用机制涉及抑制 Cdc2 样激酶 (Clks)，后者使富含丝氨酸精氨酸 (SR) 的蛋白质剪接因子家族^[58] 磷酸化。在高通量筛选中使用剪接依赖性外显子连接复合物免疫沉淀 (EJIPT) 分析，1，4-萘醌和1,4-杂环醌被鉴定为剪接抑制剂^[59]。与阻断第一次酯交换反应的其他已知抑制剂相反，这两种化合物通过阻止内含子套索释放和两个外显子的连接来阻断第二次酯交换反应体外^[59]。使用灵敏的 qPCR 方法检测体外剪接，从体外筛选中提取 Tetrocarcin A、吲哚和萘扎林。发现每种化合物都在剪接体组装的不同阶段抑制剪接，其中 tetrocarcin A 阻止第一个剪接步骤，吲哚和萘沙林阻止第二个步骤^[60]。Tetrocarcin A 和naphthazarin 也抑制酵母中的剪接体组装，表明它们的靶标是剪接体的普遍保守成分^[60]。使用 具有变性凝胶作为读数的相同体外构建体进行的类似筛选表明，源自海洋细菌链霉菌属的天然化合物 N-棕榈酰-L-亮氨酸。是一种剪接调制器^[61]。与大多数其他剪接调节剂不同，N-棕榈酰-L-亮氨酸不影响剪接体的复合物 A，而是在剪接体组装的后期发挥作用^[61]。

另一类似乎通过剪接体组装停滞影响 RNA 加工的小分子是一组蛋白质乙酰化和脱乙酰化抑制剂^[62]。根据将蛋白质乙酰化和 RNA 加工联系起来的观察结果，测试了这些分子对剪接的影响^{[63, 64]}。发现三种组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 小分子抑制剂以及三种组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 小分子抑制剂在剪接周期的中间步骤阻断前 mRNA 剪接，并使用质谱分析检测到亲和纯化的停滞剪接体^[62]。

小分子剪接调节剂的选择性

由于许多剪接调节剂似乎针对基础剪接机制，人们可能会期望这些调节剂充当通用的前 mRNA 剪接抑制剂并影响全局剪接。然而，一些观察结果表明几种特征化剪接调节剂的作用具有一定程度的特异性。例如，在 SSA 的情况下，剪接特异性微阵列分析显示对细胞分裂重要基因的 AS 模式有广泛影响，例如细胞周期蛋白 A2 和 Aurora A 激酶（图 2）^[39]。这些基因的特定剪接异构体可能会阻止细胞周期进程，从而阻止癌症生长。在 HeLa 细胞中沉默主要的 SSA 目标 SF3B1 后，观察到类似的 AS 模式^[39]。SF3B1的抑制如何导致AS变化目前尚不清楚，但一种假设是受影响的基因在定义 U2 snRNA 碱基对结合特征的 3 剪接位点序列上具有相似性<sup

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