TCP3与R2R3-MYB蛋白相互作用促进黄酮类物质生物合成并负调控拟南芥的生长素响应外文翻译资料

TCP3与R2R3-MYB蛋白相互作用促进黄酮类物质生物合成并负调控拟南芥的生长素响应

作者：Shutian Li and Sabine Zachgo

单位：Department of Botany, Osnabruck University, Barbarastr. 11, 49076 Osnabruck, Germany

摘要： TCP蛋白属于植物特异性bHLH转录因子家族，是多种发育过程的关键调节因子。家族成员之间的功能冗余和几个TCP基因的miRJAW转录后下调使它们的功能特征变得复杂。我们通过分析表达miRJAW抗性基因mTCP3和显性抑制基因TCP3SRDX的转基因植株来探讨TCP3的作用。mTCP3植株的幼苗和种子超积累黄酮醇、花青素和原花青素，而TCP3SRDX植株的原花青素含量略有下降。R2R3-MYB蛋白通过形成R2R3-MYB/bHLH/WD40（MBW）三元复合物，不仅控制类黄酮生物合成的早期步骤，而且激活晚期类黄酮生物合成基因。BiFC实验进一步证实TCP3在酵母中与R2R3-MYB蛋白相互作用。酵母三杂交实验表明，TCP3显著增强了bHLH蛋白TT8结合的R2R3-MYB的转录激活能力。mTCP3和TCP3SRDX植物的转录组分析证明TCP3在促进类黄酮生物合成中的作用。此外，在mTCP3植物中观察到一些与生长素相关的发育异常。转录组数据结合生长素响应报告和生长素外流载体的研究表明，TCP3可能是通过损害生长素的运输能力来负调控生长素响应。遗传实验表明，查尔酮合酶突变体tt4-11缺乏类黄酮生物合成，消除了mTCP3引起的生长素相关缺陷。综上所述，这些数据表明，TCP3与R2R3-MYB的相互作用导致类黄酮的产生增加，从而进一步负调控生长素响应。

关键词：TCP3，黄酮类物质，生长素响应，R2R3-MYBs，MBW复合物，透明种皮4

1 引言

植物特异的TCP转录因子家族是以前三个成员命名的：玉米中的TEOSINTE BRANCHED1，金鱼草中的CYCLOIDEA（CYC）和水稻中的增殖细胞核抗原因子。陆地植物进化过程中的重复基因复制扩大了这个含有bHLH的DNA结合蛋白家族（Martiın-Trillo and Cubas, 2010）。拟南芥基因组编码24个TCP转录因子。根据其保守的TCP结构域的结构，已有13个TCP蛋白被鉴定为I类成员（TCP-P），并被认为是细胞增殖的正调控因子（Kosugi and Ohashi, 2002）。另外11个TCP蛋白属于II类（TCP-C）。CyC控制金鱼草花对称的形成（Luo等人，1996），其拟南芥同源基因TCP1参与油菜素类固醇的生物合成并调节叶和茎的纵向伸长（Guo等人， 2010；Koyama等人，2010b）。两个II/TCP-C类基因的产物，TCP12（BRANCHED2）和TCP18（BRANCHED1），在腋芽中作为分支信号的整合因子（Aguar-Martinez等人，2007），TCP12也被证明抑制腋生分生组织的花过渡（Niwa等人，2013）。抗miRJAW和显性抑制TCPs的产生揭示了miRJAW靶向的CINCINNATA（CIN）-TCP基因（TCP2-4、TCP10和TCP24）通过调节茉莉酸生物合成来控制叶片形态发生和衰老中的功能冗余作用（Palatnik等人，2003；Schommer等人，2008）。II类CIN-TCPs还被证明调节枝条侧器官的形态发生以及纠正花瓣和雄蕊的发育（Palatnik等人，2003；Koyama等人，2007，2010a；Nag等人，2009）和防御反应（Sugio等人， 2011）。

拟南芥植物合成三类黄酮，包括无色到淡黄色的黄酮醇、红色到紫色的花青素和无色的原花青素，它们在氧化反应后变成棕色。类黄酮的生物合成在转录水平上受到很大程度的调控，从苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶和4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）等苯丙素类代谢开始。类黄酮代谢的分子剖析表明，查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄酮3-羟化酶（F3H）和黄酮3lsquo;-羟化酶分别由TRANSPARENT TESTA4（TT4）、TT5、TT6和TT7编码。这些酶催化的一系列反应产生二氢黄酮醇，这是类黄酮最终产物生物合成的最后一种常见中间体（图S1）。然后，二氢黄酮醇被黄酮醇合成酶（FLS）氧化成黄酮醇，如槲皮素和山奈酚。类黄酮生物合成途径的这些早期步骤由R2R3-MYB蛋白MYB11、MYB12和MYB111控制，它们激活早期生物合成基因CHS、CHI、F3H和FLS1（Mehrtens等人，2005；Stracke等人，2007）（图S1）。二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）由晚期生物合成基因TT3编码，将二氢黄酮醇还原为亮氨酸花青素，下游酶参与花青素和原花青素的生产（Nesi等人，2002；Appelhagen等人，2011）（图S1）。三类调控蛋白，包括R2R3-MYBS，bHLHs和TRANSPARENT TESTA GLABROUS1 （TTG1/WD40）形成三元转录复合物MYB-bHLH-WD40（MBW），激活几个晚期类黄酮生物合成基因（Nesi等人，2002；Appelhagen等人，2011）。花青素的生物合成受一个MBW复合体的调控，该复合体由TTG1、一个R2R3-MYB蛋白（产生花青素PIGMENT1（PAP1）、PAP2、MYB113或MYB114），以及一种bHLH蛋白TT8、GLABROUS3（GL3）或GLABRA3增强子（EGL3）组成（Gou等人，2011）。种子特定激活原花青素产生需要由R2R3-MYB蛋白TT2、TT8和TTG1组成的MBW复合物的活性（Nesi等人，2002；Ramsay和Glover，2005）。一些转录因子，如miR156靶向的SQUAMOSA启动子结合蛋白9（SPL9），WIP型锌指蛋白TT1和R3-MYB蛋白MYBL2，已经被证明可能是通过影响三元MBW复合物的稳定性，与R2R3-MYBs或bHLHs相互作用来调节类黄酮的生物合成（Dubos等人，2008；Appelhagen等人，2011；Gou等人，2011）。

内源性黄酮醇被认为是细胞生长素外流和极性生长素运输的天然调节器（Murphy等人，2000；Peer等人，2004；Lazar和Goodman，2006；Santelia等人，2008；Petrasek和Friml，2009）。对表达可诱导显性抑制TCP3（TCP3SRDX）的幼苗的转录组分析表明，在拟南芥叶片分化过程中，生长素的反应发生了变化，例如PIN-FORMED1（PIN1）、PIN5和PIN6的上调以及PIN3、PIN4和PIN7的下调（Koyama等人，2010a）。本工作对表达miRJAW抗性mTCP3和显性抑制TCP3SRDX的转基因植株的整个生活史进行了表征，并对新观察到的表型进行了进一步分析。我们的结果表明，TCP3刺激类黄酮的生物合成，负调控生长素响应，从而导致过多的生长素相关发育缺陷。

2 结论

2.1 表达mTCP3和TCP3SRDX基因植株的表型分析

过表达TCP3（p35S::TCP3）的拟南芥植株以及TCP3的敲除突变体没有表现出明显的表型变化，这是由于miRJAW引导的TCP mRNAs的剪切和TCP转录因子的功能冗余（表S1）（Koyama等人，2007）。为了揭示TCP3的发育作用，我们分别通过miRJAW靶点的同义替换和EAR基序抑制域与TCP3 C-末端的融合，构建了miRJAW抗性版本mTCP3和显性抑制因子TCP3SRDX（Hiratsu等人，2003；Palatnik等人，2003）。与之前的报道一致（Koyama等人，2007），24.2%的p35S::mTCP3植株形成融合子叶，导致萌发后4天内过早死亡（表S1），95.7%的p35S::TCP3SRDX植株形成波状叶片和不规则的子叶维管系统（表S2）。此外，大多数存活的转基因植物（表S1和S2）表现出以前没有观察到的表型，这支持了TCP3在植物发育过程中的进一步功能。野生型和p35S::TCP3SRDX转基因植株形成螺旋状叶序，叶首字母之间的夹角为137.5°（图1a, c）。相反，65.0%的p35S::mTCP3植株表现交叉叶序，每对叶片与前一对叶片形成90°角（图1b）。与野生型子叶中观察到的规则维管模式相反（图1d），p35S::mTCP3和p35S::TCP3SRDX转基因子叶形成了不规则的维管木质部链（图1e, f）。表达p35S::mTCP3的第一片真叶也观察到维管断裂（图S2e）。

p35S::mTCP3植株初生根生长减少，侧根形成减少（图1h）。相比之下，p35S::TCP3SRDX植物（图1i）比野生型植物（图1g）发育了更多的侧根。此外，表达p35S::mTCP3的转基因植株生长矮小，顶端优势降低，成熟时平均发育29个类似长度的枝条（图1m），而野生型和表达p35S::TCP3SRDX的植株分别为7个和9个枝条（图1m；分析了25株植株）。与棕色野生型种子（图1j）相比，携带p35S::mTCP3的植株发育出更小、更深色的棕色种子（图1k）。相反，表达p35S::TCP3SRDX的转基因植株形成了大小与野生型种子（图1j）大小相似的淡棕色种子（图1l）。此外，p35S::mTCP3植株的叶片较小，叶柄和叶片之间没有明显的区别（图S2b），花瓣较小（图S2j），花序较短，节间长度较短，角果较短，花器官脱落有缺陷（图S2m, q），以及较细的绿色茎和较细的根（图S2r, u）。表达p35S::TCP3SRDX的植株除了形成更大的叶片和花瓣外，还形成波状边缘和褶皱的角果（Koyama等人，2007）（图S2c, l, p），还在叶片的正面形成不规则的凸起（图S2c）。

同时产生了miRJAW抗性版本的TCP3SRDX，且p35S::TCP3SRDX结构在野生型植物中的表达产生了与p35S::TCP3SRDX植物中观察到的相同的表型（表S2）。为了排除由CaMV 35S启动子驱动的表达所造成的外源效应，还在TCP3位点（pTCP3::TCP3，pTCP3::mTCP3，pTCP3::TCP3SRDX和pTCP3::mTCP3SRDX）中表达了miRJAW抗性和敏感版本的TCP3和TCP3SRDX。对这些转基因群体的表型研究表明，CaMV 35S启动子和TCP3调控序列的活性相似（表S1和S2），这得到了TCP3启动子驱动普遍存在的GUS表达的观察支持（图S3）。因此，进一步的分析集中在p35S::mTCP3和p35S::TCP3SRDX植株上。

对mTCP3幼苗的分析证实了Koyama等人描述的融合子叶表型。（2007），对存活的转基因植株的进一步观察揭示了以前没有报道过的各种表型，例如叶片叶序改变，维管模式缺陷，顶端优势降低，丛生结构，根的生长和发育受损，以及器官大小减小，这意味着TCP3可能在生长素的生物合成或信号转导中发挥作用。

图1.mTCP3和TCP3SRDX植株的表型

（a-c）10日龄野生型（a）和TCP3SRDX植株（c）表现为正常螺旋叶序，而mTCP3植株表现为交叉叶序（b）。对25株独立植株进行了每种基因型的检测。

（d-f）野生型子叶形成四个木质部环，从中脉发出（d）。相反，mTCP3（e）和TCP3SRDX子叶（f）发育不连续的维管木质部。对15株10日龄独立植株的30片子叶进行了分析。

（g-i）与12日龄的野生型根（g）相比，mTCP3植株的初生根生长减慢，形成的侧根（h）较少，而TCP3SRDX植株形成的侧根（i）较多。对25株12日龄植株进行了每种基因型的分析。

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