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附录A 译文

细胞分裂周期相关基因作为肝细胞癌诊断和预后的生物标志物

肝细胞癌（hepatularcarcinoma，LIHC）死亡率高，预后差，已成为全球第四大癌症。多数LIHC患者因诊断不及时而错过了最佳治疗期。对于其他人，即使他们暂时治愈，他们也不得不面对非常低的预后生存率和非常高的复发风险。基于肿瘤细胞异常增殖和不受控制生长的特点，我们选择细胞分裂周期相关（Cell Division Cycle Associated，CDCA）家族基因作为研究对象，以探索肝癌的发生机制。CDCA家族基因负责调节细胞周期和增殖。为此，我们通过生物信息学分析方法和在线数据库，研究了CDCA家族基因在LIHC及相应正常组织中的表达，以及CDCA表达对预后和免疫细胞浸润的影响。此外，我们还分析了CDCAs的表达相关性，筛选了与CDCAs功能性相关的邻近基因。

结果显示，抛开分期、性别、种族、饮酒行为等临床因素，LIHC中CDCA1/3/5/8的表达水平均显著升高。同时CDCAs表达与不良的预后显著相关，且与树突状细胞、B细胞、巨噬细胞浸润呈正相关。研究中我们发现，LIHC中与CDCAs最相关的邻近基因是SGO2、NDC80、BIRC5、INCENP和PLOD1。因此，我们的研究表明CDCA1/3/5/8在LIHC的发生过程和LIHC患者的预后过程中具有作为诊断基因的潜力。

关键词：CDCA，肝细胞癌，生物标志物，预后，肿瘤免疫

介绍：肝癌是全球第四大癌症，估计每年的发病率超过100万例，严重危害人类健康（Bray等，2018；Llovet等人，2018）。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma， LIHC）占原发性肝癌的75-85%，是原发性肝癌的主要病理类型（Bray等人，2018）。大多数LIHC病例源于肝细胞内的乙型和丙型肝炎（Zhang等人，2004；Makarova等人，2016年）。此外，LIHC发病率的上升是由于大量饮酒和非酒精性脂肪肝的发生（Schuuml;tte等，2009年；Gish等人，2016）。虽然各种治疗技术在发展，包括手术切除、肝移植、介入治疗、化疗、放疗等，可以在一定程度上降低死亡率，但LIHC患者的5年生存率仍然很低，只有20～30%（Pang等人，2008；Yang等人，2009）。因此，我们迫切需要加深对LIHC肿瘤的认识，开发新的治疗和监测方法，以尽早发现并延长LIHC患者的生存期。细胞分裂过程中的任何失调都可能导致恶性肿瘤（Collins and Garrett，2005）。细胞分裂周期相关（Cell Division Cycle Associated，CDCA）家族蛋白包括CDCA1～8的8个成员，具有调节细胞周期和增殖、影响生物过程的重要作用。既往研究表明，CDCA家族基因会在肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等中表达水平显著上调。这种高表达通常与不良的预后相关。例如，CDCA基因在卵巢癌组织中高表达，并作用于PLK通路促进肿瘤侵袭和转移（Chen等人.，2020a；陈等人，2020b）。CDCA7可通过调节细胞周期加速肺腺癌和非小细胞肺癌的增殖（Wang等人，2019）。乳腺癌中CDCA3/5/7/8 mRNA的高表达显著降低了患者的生存率（Phan等人， 2018）。这些发现强烈提示了CDCA在肿瘤发生和患者预后中的潜在作用。了解CDCAs在LIHC中的作用机制是必要和有意义的，然而，目前还没有对LIHC中CDCAs系统、全面的分析。

揭示LIHC的发生机制可以为LIHC患者寻找诊断和预后标志物或治疗靶点，本研究通过Oncomine和GEPIA对CDCA基因的转录水平进行了研究，发现CDCA1/3/5/8在LIHC中的表达水平显著升高。我们还评估了CDCA1/3/5/8对LIHC患者预后的影响。具体来说，我们分析了CDCAs表达对LIHC患者预后生存率的影响，通过Kaplan-Meier曲线分析了CDCAs转录与各种临床因素的相关性，并通过cBioPortal分析了CDCAs基因改变对预后的影响。利用TIMER 2.0分析了CDCA1/3/5/8与免疫细胞浸润的关系。此外，利用GeneMANIA绘制了CDCAs与邻近基因之间的相互作用网络。

材料和方法

Oncomine分析

Oncomine平台（https://www.oncomine.org/）是一个可公开访问的在线肿瘤相关基因微阵列数据库，用来收集相关基因表达谱和相关临床信息。用Oncomine对近200份样本分析了CDCA家族基因（CDCA1～8）在不同肿瘤及相应正常组织中的转录水平。当fold change gt; 2.0 且p值lt; 0.0001时，认为差异显著。我们将基因排序的阈值设置为“top 10%”，数据类型设置为“mRNA”（Rhodes等人，2007）。

GEPIA分析

使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）基于GTEx和TCGA数据库分析肝癌组织中CDCAs测序的表达（Tang等人，2017）。采用GEPIA法，以|Log2 （Fold Change）| lt;1和p-valuelt;0.01为阈值比较CDCAs在HCC中的表达水平。使用默认参数分析CDCAs在HCC不同阶段的表达。

Kaplan-Meier plotter分析

采用Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis/）评估CDCA家族基因不同表达水平对肝癌患者预后价值，包括总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）、无复发生存期（RFS）、无进展生存期（PFS）的影响。同时对数据库中的所有样本进行分析。

cBioPortal分析

使用cBioPortal （http://www.cbioportal.org/）对TCGA数据库中的肿瘤组织中的生物分子进行交互分析（Gao等人，2016）。我们用它来分析CDCAs基因改变的频率。使用GISTIC 2.0确定的370例样本进行分析。在“比较/生存模块”中，我们分析了改变默认参数对HCC患者预后生存的影响。

GeneMANIA分析

GeneMANIA （http://genemania.org/）基于许多大型公开可用的生物数据集，用于识别基因组内的关联并发现共同表达的生物分子。使用GeneMANIA，在默认参数下，分析CDCAs与20个相关基因在人类数据集中的物理相互作用和共表达作用。

TIMER2.0分析

利用TIMER 2.0（http://timer.comp-genomics.org/）分析CDCAs表达与肝癌组织免疫细胞浸润水平的关系。基于生物标志物基因表达分析，利用TIMER数据库确定肿瘤浸润物的纯度（Li等人，2017）。在这里，我们选择CDCA1/3/5/8作为输入，然后在免疫关联模块下检测癌细胞。根据Li等人的研究，B细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞被作为测试类型。（Li等人，2016；Danaher等人，2017）。基因表达值被转换为Log2 RSE值。

结果

细胞分裂周期在肝细胞癌和其他癌症中的表达

细胞分裂过程中的任何失调都可能导致恶性肿瘤。据报道，CDCA家族基因有8个成员，这些基因能发挥独立作用或协同作用。Oncomine分析显示，大多数CDCA基因成员在多达15种癌症中都有显著的上调（图1）。特别是对于LIHC，我们发现Oncomine和GEPIA数据库的结果是一致的。即CDCA1、CDCA3、CDCA5和CDCA8在LIHC中的表达明显高于正常组织。因此，这些基因被选作后续分析和研究的对象。

为了评估癌细胞的增殖程度和确定患者的潜在预后情况，肿瘤的发展通常分为四个阶段。在这项研究中观察到上述四个CDCA基因成员在肝癌不同阶段的显著差异，表明这四个基因可能在肝癌的整个过程中起作用（图2B）。

图1 通过Oncomine分析各种正常或癌组织中CDCAs的表达水平

图2 通过GEPIA分析LIHC中CDCAs的表达水平

细胞分裂周期相关表达在肝癌中的预后潜力

使用Kaplan-Meier Plotter，我们发现，四个CDCA基因的转录水平与肝癌患者的预后生存率显著相关（图3）。具体来说，CDCAs的高表达在OS、DSS、RFS和PFS代表了预后不良，表明CDCA1/3/5/8的活跃转录可能导致健康风险。因此这些基因可能是LIHC患者的潜在预后生物标志物（图4）。

图3 GEPIA分析LIHC患者CDCAs表达与肿瘤分期的相关性。

图4 通过Kaplan-Meier图分析CDCAs表达与LIHC患者预后生存的相关性(模拟)之间的相关性CDCA1表达及生存曲线

对于不同类型的临床因素，我们进一步分析了CDCA1/3/5/8基因的表达水平与预后OS的关系。在这里，我们得出的结论是无论性别、种族或饮酒情况如何，CDCAs的高表达水平导致预后不良。值得注意的是，当LIHC患者没有肝炎病毒或血管感染时，CDCA1/3/5/8的表达与生存率显著相关。有趣的是，当LIHC患者有肝炎病毒或血管感染时，只有CDCA8与患者的生存率显著相关。

肝细胞癌中细胞分裂周期相关变化分析

我们在TCGA数据库中提取了CDCA1/3/5/8基因并调查了基因改变的百分比。在总共360个样本中，CDCA的改变频率在LIHC中高达29.44%（106/360）（图5A），CDCA1为27%，CDCA3为0.8%，CDCA5为7%，CDCA8为6%（图5B）。接下来，我们对具有（或不具有）CDCA基因改变的病例与预后进行了相关性分析。CDCA的改变与总体生存率（4.348e-3）和无病生存率（7.932e-3）（图5C）之间存在着显著的相关性，这意味着这些改变将加剧由高表达介导的肝癌发生。

图5 LIHC患者CDCA改变频率分析及其对预后的影响

肝细胞癌中细胞分裂周期相关表达水平与免疫细胞浸润的相关性分析

使用TIMER 2.0来研究CDCA1/3/5/8的表达与免疫细胞（CD8 T细胞，CD4 T细胞，B细胞，中性粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞）浸润水平之间的相关性。总的来说，CDCA的基因表达与LIHC中大多数免疫细胞之间存在着统计学上显著的正相关。详细来说，CDCAs与CD8 T细胞和中性粒细胞的相关性较差，但与树突状细胞、B细胞和巨噬细胞的相关性较强（图6）。

图6 通过TIMER 2.0分析CDCAs表达与LIHC患者免疫细胞浸润水平的相关性

为探索CDCAs介导的免疫机制和筛选潜在治疗靶点，我们进一步研究了CDCA1/3/5/8和免疫细胞的生物标志物基因及KIRC亚群表达水平的相关性。我们发现CDCA基因与树突状细胞和B细胞的所有生物标志物基因均呈正相关。虽然CDCAs与M1和M2巨噬细胞的大部分生物标志物基因呈显著正相关，但CDCA1/3/5/8与巨噬细胞生物标志物iNOS无相关性。此外，CDCA3与COX2或CD163之间没有相关性。

肝细胞癌中细胞分裂周期的共表达和相互作用

在基因水平上，利用cBioPortal分析CDCA1/3/5/8四个成员基因在肝癌患者中的表达相关性。根据我们的结果，Pearson相关系数在0.85～0.90之间，表明这4种CDCA在LIHC中的表达模式具有很强的相关性。GeneMANIA数据集用于探索CDCAs与其他生物分子的共表达。我们发现CDCA1、CDCA3、CDCA5和CDCA8之间存在物理相互作用。如图7B所示CDCAs与20个最常见邻近基因的相互作用网络。在LIHC中，前5位的CDCA邻近基因分别为SGO2、NDC80、BIRC5、INCENP和PLOD1。

讨论

LIHC死亡率高，预后差，已成为全球第四大癌症（Bray 等人，2018）。大多数LIHC患者因诊断不及时而错过了最佳治疗期，对于其他人来说，即使他们暂时治愈，他们也不得不面对非常低的预后生存率和非常高的复发风险。根据肿瘤细胞异常增殖和不受控制生长的特点，我们选择负责调控细胞周期和增殖的CDCA基因作为研究对象，探讨肝癌发生的机制。通过一系列生物信息学分析方法和使用公开可访问的在线数据库，包括Oncomine、Kaplan-Meier plotter、GEPIA、GeneMANIA、cBioPortal和TIMER 2.0，我们研究了CDCA家族基因在LIHC和相应正常组织中的表达，以及CDCAs表达对患者生存、预后及免疫细胞浸润的影响。此外，我们还分析了CDCA的表达相关性，并筛选了与CDCA功能相关的邻近基因。

我们发现CDCA1/3/5/8在LIHC中表达水平显著升高，且与分期、性别、种族、饮酒行为等临床因素无关。CDCAs表达与OS、DSS、RFS、PFS预后不良显著相关，与树突状细胞、B细胞、巨噬细胞浸润呈正相关。总之，我们的研究表明CDCA1/3/5/8有潜力成为LIHC患者肝癌发生和预后的诊断基因。

CDCA家族由8个独立个体组成，命名为CDCA1～8。为了阐明CDCAs在LIHC中的作用，我们进行了多个数据库分析，发现CDCA1/3/5/8在LIHC组织中高表达。CDCA1/3/5/8在LIHC各阶段均有表达，表明CDCA

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