通过计算机信息实验研究和体外验证来鉴定新型上皮性卵巢癌的候选药物外文翻译资料

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通过计算机信息实验研究和体外验证来鉴定新型上皮性卵巢癌的候选药物

摘要 上皮性卵巢癌（EOC）预后较差，死亡率较高；采用标准治疗方法的患者很容易再次复发。因此，迫切需要开发新的药物。在本研究中，我们在癌症基因组图谱（TCGA）数据库和基因表达综合数据库（GEO）数据库中鉴定了EOC的差异表达基因（DEGs）。进行了富集和蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析。通过连通性图（CMAP）数据库预测了有可能治疗EOC的候选药物。此外，我们还选择了分子对接技术来计算药物候选基因与枢纽基因之间的结合亲和力。采用MTT和集落形成分析来评价候选药物的细胞毒性，用免疫印迹法检测枢纽基因编码的蛋白，用流式细胞术以进行细胞凋亡分析。最后，从PPI网络中筛选出296个重叠的差异表达基因（|log₂倍变化|gt;1；q值lt;0.05）（plt;0.05）和周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）作为重要枢纽基因。此外，从CMAP数据库中筛选出21种药物，其中哌龙胺（PL）的CMAP评分较低（-0.80，-62.92），被认为是候选药物。此外，PL和CDK1之间的分子对接结果为-8.121 kcal /mol，与已知的CDK1抑制剂（-8.24 kcal /mol）非常接近。此外，体外实验表明，PL通过以CDK1为靶点，抑制EOCSKOV3细胞的增殖并诱导细胞凋亡。我们的研究结果表明，PL可能通过抑制细胞周期成为一种新的EOC候选药物。

引言

上皮性卵巢癌（EOC）是一种强侵袭性的恶性肿瘤，通常在晚期才被诊断出。目前，最常见的治疗方法是手术与铂类结合化疗结合。然而，60%的患者在一期治疗后复发，50%的患者出现化疗的耐药性。一般认为EOC化疗耐药参与了细胞周期的DNA损伤反应（DDR）过程，特别是聚ADP-核糖聚合酶（PARP）的单链DNA断裂修复和BRCA1/2基因同源重组修复（HRR）的双链修复。

目前在卵巢癌的治疗中，针对细胞周期特定阶段的药物，如周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKIs），已在临床试验中显示出良好的疗效。例如，CDK抑制剂，一种CDK4/6抑制剂，作用于细胞周期的G1期，已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于治疗乳腺癌；它也在II期临床试验中用于治疗卵巢癌（NCT02657928）。此外，AZD5438，一种CDK1/2抑制剂，通过损害双链断裂（DSBs）的HRR来增强非小细胞肺癌的放射敏感性，并且已经在临床前阶段进行了测试。因此，有人认为靶向细胞周期是一种新的、有效的肿瘤治疗方法。然而到目前为止，只有少数CDKIs被开发用于治疗卵巢癌；因此，需要开发更多更有效和更安全的药物来治疗卵巢癌。

药物再利用是一种非常规的，用于识别已批准或实验性药物的新适应症的方法。有几个成功的例子，例如，沙利度胺最初是作为一种妊娠期止吐剂而开发的，但目前在多发性骨髓瘤的治疗中获得了巨大的市场。被广泛用于2型糖尿病的一线治疗的二甲双胍已被发现具有额外的抗癌特性。因此，对已知药物的再利用是一种可行的药物开发策略。在本研究中，我们通过直接关注EOC数据集，通过综合生物信息学和体外实验开发一种治疗EOC的新药。它主要基于连通性图谱（CMAP）数据库，该数据库通过大量的细胞系实验来连系基因、药物和疾病。然后，利用分子对接技术匹配潜在的药物，筛选出蛋白质。此外，我们还使用了体外实验来验证我们的预测。我们的研究在一定程度上为EOC的潜在治疗提供了依据。

材料和方法

数据源和差异表达基因采集

从RNA-seq数据和微阵列表达数据集中整合了肿瘤组织和正常组织的上皮性卵巢癌的相关mRNA数据。首先，分别从癌症基因组图谱（TCGA）数据库（http://cancergenome.nih.gov/）和基因型组织表达项目（GTEx）项目（https://gtexportal.org/home/）中收集RNA-seq数据。从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收集了微阵列表达数据集，并利用GPL590平台选择了两个基因表达谱（GSE14407和GSE54388）。然后，用R包Limma（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html）以 |log₂（FC）|gt;1和校正后的p值lt;0.05的标准检测差异表达基因（DEGs）。此外，RNA-seq数据的差异分析被log₂（TPM 1） 转化，并通过基因表达谱交互分析（GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/）进行分析。

功能富集分析

我们利用在线生物信息学数据库Metascape（http://metascape.org/），进行基因本体论（GO）生物过程和京都基因和基因组百科全书（KEGG）途径富集的分析以及蛋白质相互作用（PPI）的建立。在本研究中，显著性的条目都符合p值lt;为0.05和富集基因数量为ge;3的标准。

PPI网络模块的分析与枢纽基因的鉴定

为了可视化和分析PPI网络，我们使用了Cytoscape（版本 3.7.0）软件（http://www.cytoscape.org/）。首先，利用Cytoscape的分子复合物检测（MCODE）插件对分子模块进行分析。参数设置已设置为默认值。标准设置如下：MCODE评分gt;3，节点数为gt;4。接下来，利用推荐的以最大团中心性（MCC）为排序方法的CytoHubba插件从PPI网络中筛选枢纽基因。排名前10位的基因即为枢纽基因。

EOC相关药物预测和基因集合富集分析（GSEA）

CMAP，是通过查询上调和下调基因的基因列表来连接基因、药物和疾病状态。通过估计所谓的连通性评分来评估预测的优先级；正分数表示药物对查询的信号的刺激作用，而负分数表示药物对查询的信号的抑制作用，这基于不同的数据和算法。CMAP作为第一代连接图平台，使用了一个微阵列平台，筛选1309种FDA药物在5种细胞系中研究，连通性评分从-1到1。然后，LINCS，下一代的连接图，包括476251个全基因组表达特征表达谱，从L1000谱中收集了72个细胞系刺激的27927个扰动因子。连接性得分在-100到100之间。此外，为了研究受小分子药物影响的通路，我们从CMAP数据库中选择原始数据，并使用聚类分析器包中的GSEA功能和p值lt;0.05，FDRlt;0.25的标准进行分析。

EOC的候选药物和枢纽基因之间的分子对接

由枢纽基因编码的蛋白质的晶体结构来自RCSB蛋白数据库 （PDB）（www.rcsb.org/pdb/home/home.do）此外，药物的三维结构可以从PubChem（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）网站获得。分子对接过程包括制备蛋白质和配体，建立网格，并对接化合物；这些都是使用薛定谔Glide对接工具（薛定谔有限责任公司，NY，美国）完成的。通过对接评分和分子构象的合理性，筛选出最佳位姿。

结果

重叠的EOC的差异表达基因的鉴定

本研究通过不同的GEO mRNA微阵列数据集（GSE14407和GSE54388）和TCGA mRNA-seq数据集，对EOC进行综合生物信息学分析，确定了DEGs及其显著的生物学特征。共采集560个样本，包括454个EOC组织和106个正常组织 （GSE54388：16T/6N；GSE14407：12T/12N；RNA-seq： 426T（TCGA）/88GTEx）。经过基因表达分析、数据处理和归一化后，我们使用Limma，|log₂（FC）|gt;1，调整后的p值lt; 0.05。总的来说，从GSE54388数据集中共筛选出 1188个差异表达基因，其中包括518个上调基因和670个下调基因。GSE14407中有711个差异表达基因，其中上调基因255个，下调基因456个。此外，从TCGA数据集中选择了7615个差异表达基因，其中包括2606个上调基因和5009个下调基因。为了确认EOC中差异表达基因的可靠性，我们获得了三个数据集的重叠DEGs，其中包括115个常见上调基因和181个常见下调基因。

功能富集分析

我们选择了重叠的差异表达基因来研究EOC在GO和KEGG通路中的富集。首先，差异表达基因的KEGG通路主要是细胞周期、卵母细胞减数分裂和p53信号通路，这些通路与多种肿瘤的发展有关，参与了EOC肿瘤的发生和发病机制。在GO_BP富集分析中，它们在细胞周期和凋亡中富集，如细胞分裂、有丝分裂核分裂和有丝分裂姐妹染色单体分离。在GO_MF分 析中，它们富集于DNA复制起始点结合和微管结合。在GO_CC分析中，它们富集于纺锤体、染色体区、微管等方面。这些结果表明，差异表达基因可能与细胞增殖过程有关。此外，下调的差异表达基因的KEGG通路在酪氨酸代谢、药物代谢-细胞色素P450和视黄醇代谢中富集、。

PPI网络模块的分析与枢纽基因的鉴定

此外，我们构建了图3A、B所示的PPI网络，并通过Cytoscape的MCODE插件将整个网络聚类为三个模块。模块1包括所有常见的上调基因，并在细胞分裂、染色体分离和有丝分裂姐妹染色单体分离中富集，这些基因与G2/M期相关。模块2由一个共同的上调基因和一个共同的下调基因组成，富含有丝分裂细胞周期、细胞周期过程和有丝分裂细胞周期阶段转变的调控。模块3包含了所有常见的下调基因，但没有准确的分析结果。

接下来，通过Cytoscape的CytoHubba插件在重叠的差异表达基因中选择枢纽基因。将前10个基因筛选为枢纽基因，包括CDK1、 CDC20、BUB1B、CCNB1、CDCA8、NUF2、SPC25、CENPF、 CENPK、ZWINT，按降序排列。CDK1得分最高，被选为显著枢纽基因。CDK1在卵巢癌组织中的表达水平显著高于正常组织。此外，CDK1表达水平的升高与卵巢癌患者的不良预后相。

EOC相关药物和GSEA

使用EOC相关的重叠差异表达基因分别查询CMAP和LINCS。通过整合评分＜0且p值lt;为0.05的两个数据库中的药物，我们发现21种药物被分为两个簇；我们选择了簇2中得分较低的4种药物（哌龙胺、阿霉素、伏立司他、甲氨蝶呤）在这两个数据库中都被认为是潜在的药物。其中，3种药物（阿霉素、伏立司他、甲氨蝶呤）已在临床实践或临床试验中用于治疗EOC；PL的连通性评分最低，有证据表明它可以治疗EOC。此外，哌龙胺共富集了28条途径，包括DNA复制、核苷酸切除修复、错配修复和同源重组，这与EOC增殖和耐药机制密切相关。因此，我们以哌龙胺（PL）为候选药物。

药物候选基因与枢纽基因的相互作用

为了进一步预测PL是否可以直接成为CDK1的抑制剂，我们使用薛定谔Glide对接工具进行了分子对接。令人惊讶的是，我们发现PL对CDK1蛋白表现出良好的结合亲和力，对接评分为-8.121 kcal/mol，与已知的CDK1抑制剂 AZD5438（-8.24 kcal/mol）很接近。大多数药物似乎都有相同的评分范围，从-8.121到-2.662 kcal/mol。如所示，我们观察到得分最高的配体，如PL，通过侧链的氢键与Leu-83、GLN132和GLN-49三个残基相互作用。综上所述，我们的数据表明，PL可以结合到CDK1上的一个类似口袋的结构上。

讨论

在目前的研究中，我们利用基因表达的数据，确定了一组可能治疗EOC的药物。首先，通过合并TCGA mRNA-seq数据集和GEO mRNA微阵列数据集，我们生成了重叠的差异表达基因作为EOC的信号。然后，通过整合CMAP和LINCS数据库，我们确定了具有较低的负连接分数的潜在药物，可以明显逆转EOC的信号。根据文献，其中四种药物曾在临床上用于治疗EOC，且作为一线治疗或临床试验药物。这意味着我们在没有任何进一步的药物信息提示的情况下，成功地预测了一组已知的EOC药物，这表明我们确定的剩余药物（哌隆脲）也有很高的可能性治疗EOC。据报道，哌胺可以抑制几种癌症，但其中只有一项研究关注卵巢癌。在我们的研究中，我们通过分子对接实验和体外实验进一步探索了PL在EOC中的潜在应用。

通过合并TCGA和GEO的EOC数据集，共发现247个EOC基因为重叠基因，其中包括103个常见上调基因和144个常见下调基因。常见的上调基因主要富集于有丝分裂细胞周期的G2/M过渡和p53信号通路中，这被认为是EOC发生和转移的关键途径。并从PPI网络中选择CDK1作为重要的枢纽基因。众所周知，消除CDK1-CCNB1的活性会阻断进入有丝分裂周期，并阻断细胞在G2期。

我们计算了CMAP和LINCS的数据集来识别新的EOC药物。虽然CMAP取得了显著的成功，但它的一些局限性却不容忽视。例如，只使用了5种人类癌细胞系，而不是所有的小分子都进行了测试。其他缺点包括剂量和时间点的限制等。令人受到鼓舞的是，LINCS涵盖了72个人类细胞系和各种细胞扰动，包括15000个小分子化合物和5000个基因（基因沉默和过表达）。因此，我们利用LINCS数据集提高了CMAP的可靠性。本研究中，连通性评分

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