Salvia白肋菇的化学指纹图谱及高效液相色谱法定量分析外文翻译资料

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药学与生物医学分析杂志48(2008)100-104

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药学与生物医学分析杂志

约翰·罗恩·马丁·路德·金。Elseer.Com/locate/jpba

Salvia白肋菇的化学指纹图谱及高效液相色谱法定量分析

关键词:

鼠尾草。

高效液相色谱

质量控制

指纹

A b s t r a c t

为控制Salvia白灵的质量，建立了高效液相色谱法与光电二极管阵列检测器(HPLC-DAD)联用的指纹图谱分析方法，并对咖啡酸、木犀草素-7-葡萄糖苷、nepetin-7-葡萄糖苷、同潘他宁、木犀草素、nepetin和hispidulin7种生物活性物质进行了定量分析。在指纹图谱分析中，选取了十二个峰作为特征峰。在定量分析中，7个化合物在试验范围内回归良好(r20.9995)，方法回收率在91.7ー103.2%之间。其中7种化合物的含量分别为0.80-1.67(hispidulin)、2.18-5.75(homoplanaginin)、0.52-1.22(nepetin)、1.56-3.48(nepetin-7-glucoside)、0.12-0.24(木犀草素)、0.97-2.22(木犀草素-7-glucoside)和0.21-0.44(咖啡酸)。结果表明，同源抗菌素的含量最高。此外，首次从侧耳中分离到木犀草素和木犀草素-7-葡萄糖苷。

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1.引言

鼠尾草。是一年生或两年生草本植物，在许多国家广泛分布，特别是在中国和印度。它已被用作民间药物治疗肝炎，咳嗽，流感和痔疮。对白背飞虱的化学成分研究表明，白背飞虱中含有黄酮类化合物[1-3]、木脂素类化合物[4,5]、二萜类化合物[6]、脂肪族化合物[7]和咖啡酸[8]。由于不同的种植面积和气候条件，其化学成分可能会有很大的差异。现代药理学和临床研究表明，猪肋菇具有不同的生物活性，如抗菌[8]、保肝[9,10]、抗氧化[3,11]和抗肿瘤活性[12]。

目前尚无高效液相色谱法对其进行分析。由于白肋烟的应用日益广泛，迫切需要开发一种适合白肋烟的质量控制方法。中药化学质量控制应从两个方面入手。一种是对一种或多种高含量成分进行定性和定量分析。另一个是化学指纹分析，这已经被世界卫生组织、美国食品药品管理局(2000年)和其他权威机构作为一种技术引入和接受

*通讯作者:华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237梅龙路130号311#信箱。Tel.: 862164253715;传真: 862164250068。

电邮地址:luyanhua@ecust.edu.cn(Y.-h.Lu)。

0731-7085/$-参见前页2008Elsevierb.v.保留所有权利:10.1016/j.jpba.2008.05.027

草药质量评价能力评价。在过去十年中，由HPLC、HPTLC、GC和CE建立的色谱指纹图谱已被公认为快速和可靠的鉴别和鉴定草药的方法[16,17]。在上述方法中，高效液相色谱法是最常用的方法，在指纹图谱分析中得到了广泛的应用。

在本研究中，我们建立了一种HPLC-DAD方法用于白背飞虱的鳍状指纹分析。以相同的速度，首次同时测定了七种酚类化合物。因此，我们可以从不同的角度来控制植物的质量。

2.实验性

2.1.植物材料和试剂

收集了10批来自中国不同省份的胸膜肺炎链球菌原料样品。所有凭证标本，由教授严华卢，保存在生物化学研究所，华东理工大学，上海200237，中国。

高效液相色谱级甲醇是从加拿大安大略省CaledonLaborato-riesltd.购买的。再蒸馏水是在我们自己的实验室里准备的。上海上海化工有限公司生产的冰醋酸为分析级。所有的溶液在使用前都经过0.45m的膜(Schleicheramp;Schuell，Dassel，Ger-many)和超声波除气。

图1。组织化学结构:组织化学结构:组织化学结构:组织化学结构:组织化学结构。

2.2.仪器和色谱条件

^{在安捷伦1100液相色谱系统上进行了色谱分析，该系统配有工作在190-400nm范围内的二极管阵列检测器、季铵盐溶胶-通风输送系统、柱温控制器和自动采样器。用安捷伦色谱工作站软件对色谱数据进行记录和处理。在ZorbaxEclipseXDB-C18柱(250mm4.6mm，5m)上进行了30oc的分析。线性梯度洗脱}

采用0.5%的洗脱液a(0.5%，v/v的冰醋酸水溶液)和b(甲醇)进行分离。对洗脱方案进行了优化:线性梯度为38-42%b，范围为0.0-14.0min;线性梯度为42-45%b，范围为14.0-17.0min;

在17.0ー17.1min范围内，b的浓度为45ー48%，b的浓度为48ー50%，b的浓度为17.1ー32.0min，b的浓度为50ー85%，b的浓度为32.0ー40.0min。在注入每个样品之前有10分钟的平衡时间。峰值是用DAD记录的

图二。(a)混合标准化合物的色谱图:(1)咖啡酸;(3)木犀草素-7-葡萄糖苷;(4)nepetin-7-葡萄糖苷;(6)同潘他宁;(7)木犀草素;(8)nepetin;(10)hispidulin。(b)342nm高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)标准化色谱指纹图谱。

102x.f.Jin等/JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis48(2008)100-104

吸光度为342nm，溶剂流速为1.0ml/min。

2.3.从侧耳中制备的参比化合物

以95%乙醇为溶剂，在室温条件下，用完全提取的方法提取了一定量的白肋烟干粉。萃取物在减压下用旋转蒸发器浓缩成残留物，然后悬浮在去离子水中，分别用石油、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取[18]。

乙酸乙酯提取物用硅胶柱200目，用氯仿/甲醇洗脱，得到4种提取物。以葡聚糖凝胶柱层析法(SephadexLH-20)对组分3进行反复层析，得到组分1,1,2,3,3,4,4,4,4,4,4-二硫杂环己烷(hispidulin，nepetin，木犀草素)。

正丁醇提取物用硅胶柱(200目)，用氯仿/甲醇洗脱，得到5个组分。分数3和分数5在SephadexLH-20上反复进行色谱分析。从流分3中分离得到nepetin-7-葡萄糖苷、同甘素和木犀草素-7-葡萄糖苷，从流分5中分离得到咖啡酸。

7个化合物(组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸组氨。木犀草素和木犀草素-7-葡萄糖苷为首次分离得到。经高效液相色谱峰面积归一化法测定，各化合物的纯度均大于98%。准确称量并溶于甲醇中，然后稀释到合适的浓度范围，建立了标准物质的校正曲线。所有库存和工作标准的解决方案存储在4oc，直到用于分析。

2.4.样本制备

^{所有样品均研磨成粉末，在50oc的温度下烘干，直至达到恒重。用20ml70%(v/v)的甲醇水溶液在超声波浴中浸提2h，然后在室温下冷却。提取物用玻璃棉过滤，样品清洗后用70%甲醇稀释至25毫升。样品溶液经0.45m滤膜过滤后进行高效液相色谱分析，注射量为5l。}

2.5.数据分析

采用国家食品药品监督管理局编制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)进行数据分析。计算了样品的整个色谱图的相关系数，并计算和生成了模拟平均色谱图。比较了不同色谱模式的相似性和被测样品的平均色谱图。

3.结果和讨论

3.1.高效液相色谱条件的优化

本研究对色谱柱、流动相、检测波长、梯度洗脱条件等进行了研究，以期提供更多的化学信息和更好的分离效果。

对ZorbaxEclipseSB-C18色谱柱(250mm4.6mm，5m)和ZorbaxEclipseXDB-C18色谱柱(250mm4.6mm，5m)进行了研究，发现ZorbaxEclipseXDB-C18色谱柱更为合适，分离效果好，峰尖锐。

考察了流动相组成对色谱分离的影响，发现甲醇-水和乙腈-水没有明显区别。考虑到乙腈的高毒性和价格，选择甲醇-水二元混合物，加入0.5%(v/v)乙酸改善峰形。由于等度洗脱中部分后洗脱峰的保留时间较长，故采用梯度洗脱方法进行分析。采用高效液相色谱梯度洗脱，在45.0min内获得了满意的分离效果。

检测植物中成分的波长由二极管阵列检测器选择。通过对七种有效成分的全扫描实验，选择波长为254,280和342nm的样品进行峰数和峰间距的比较。在254和280nm处测得的色谱图显示，前5min内有大于342nm的色谱峰。然而，由于基线噪声的严重影响，在254和280nm以下得到的一些峰并没有得到很好的分离。因此，选择342nm作为检测波长。

3.2.提取方法的优化

设计并评价了4种相关的萃取条件:萃取方法(超声波、回流)、甲醇浓度(50、70和100%，v/v)、溶剂体积(10、20和30ml)和萃取时间(1、2和2.5h)。通过比较不同色谱条件下各色谱图中特征峰的数目和面积，确定了以20ml70%(v/v)的甲醇水溶液在超声波条件下超声波提取各干样品中的1.0g粉末为最佳提取条件。

3.3.定量分析的方法验证

方法的线性关系、检测限和定量限、精密度、重现性和回收率等方面进行了验证。

用标准溶液检测线性。混合原液分别为:异麦芽糖苷(0.216mg/ml)、高效凝胶(0.224mg/ml)、奈培丁(0.224mg/ml)、奈培丁-7-葡萄糖苷(0.200mg/ml)、木犀草素(0.200mg/ml)、木犀草素-7-葡萄糖苷

(0.220mg/ml)和咖啡酸(0.190mg/ml)。0.1,0.2,0.5,1.0,1.5和2.0ml的原液分别放入10毫升的容量瓶中，用甲醇调整标准曲线。每个校准曲线包含六个不同的浓度，一式三份进行。每种标准工作液的浓度为10l，经HPLC-DAD分析。每种化合物的线性是通过绘制每种分析物的峰面积(y)与浓度(x)的关系来建立的，该关系用表1中给出的方程表示。所有的校正曲线均在试验范围内显示良好的线性回归(r20.9995)。

采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)分别在信噪比(s/n)为3和10的条件下测定了检测限和检测限。含有7种对照品的标准溶液用甲醇稀释到一系列适当的浓度，然后注射10l的稀释溶液进入HPLC进行分析。分析物的检出限和检出限分别小于1.42和4.73ng。

利用日内和日间变化来确定精度，通过分析日内变化来确定精度

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