妊娠后期子宫内砷暴露的影响雌性CD-1小鼠生殖终点和代谢参数的研究外文翻译资料

妊娠后期子宫内砷暴露的影响雌性CD-1小鼠生殖终点和代谢参数的研究

原文作者 Karina F. Rodriguez,Erica K.Ungewitter,Yasmin Crespo-Mejias,Chang Liu,Barbara Nicol,1 Grace E. Kissling,and Humphrey Hung-Chang Yao.

单位 Reproductive Developmental Biology Group, Reproductive and Developmental Biology Laboratory, and 2Biostatistics Branch, National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, Research Triangle Park, North Carolina, USA

摘要:背景:小鼠在子宫内的高水平砷暴露会造成成年后患肿瘤概率提高，如肝癌和肺癌。但是目前关于宫内砷暴露对生殖、代谢等一般生理功能的影响尚不清楚。目标：根据美国环境保护署(EPA)饮用水标准(10 ppb)和肿瘤诱导水平(42.5 ppm)评估了子宫内接触无机砷对生殖终点和代谢参数的影响。方法：怀孕的CD-1小鼠从妊娠第10天到分娩（器官形成的关键时期）一直暴露于亚砷酸钠[无（对照），10 ppb，或42.5 ppm]的饮用水中。出生后，暴露的后代与未暴露的雌鼠对比。本研究检查了成年后暴露雌鼠的生殖终点（阴道开放时的年龄、生殖激素水平、发情周期性和生育能力）和代谢参数（体重变化、激素水平、体脂肪含量和葡萄糖耐受性）。结果：接触砷的雌鼠（10 ppb和42.5 ppm）出现阴道开放的早期开始。当雌鼠暴露在10 ppb剂量下时，生育率没有受到影响。然而，暴露在子宫内砷含量为42.5 ppm的雌性大鼠，每只雌性大鼠的产仔数有所减少。在10 ppb和42.5-ppm组中，暴露于砷的雌性大鼠体重增加、体脂肪含量和葡萄糖耐受性显著增加。结论：本研究揭示了子宫内砷暴露的产生的特殊影响：在雌性CD-1小鼠中，同时暴露于与人类相关的低剂量和肿瘤诱导水平会导致早期阴道开放和肥胖。

关键词：动物实验； 砷暴露； 妊娠

介绍：

成人疾病的发育起源与心血管疾病有关(Barker et al. 1989; Forseacute;n et al. 1999)，糖尿病 (Fall et al. 1998; Vignini et al. 2012)，癌症和生殖障碍，如多囊卵巢综合征 (Xita and Tsatsoulis 2010; Xu et al. 2014)。母亲的营养和身体状况以及在怀孕期间接触到的各种环境有毒物质是导致其子女成年后易患各种疾病的重要因素 (reviewed by Boekelheide et al. 2012)。其中一种环境毒物是无机砷。砷是一种非金属，自然存在于环境中，是饮用水 (Smedley and Kinniburgh

2002) 和水稻等作物中的常见污染物 (Charnley 2014)。在美国，美国环境保护署（EPA）规定的饮用水中砷的最大污染水平为10 ppb (parts per billion; U.S. EPA 2002)。美国的许多私人水井和世界其他地方的地下水的砷含量都大于10 ppb (even gt; 5,000 ppb; reviewed by Smedley and Kinniburgh 2002)。

妊娠期是砷中毒的敏感期 (Devesa et al. 2006; Kozul-Horvath et al. 2012)。人类长期接触无机砷会导致心血管疾病、糖尿病、皮肤癌、肺癌、肝癌、膀胱癌和前列腺癌发生概率提高 (Brauml;uner et al. 2014; Moon et al. 2013; Smith et al. 2013; Steinmaus et al. 2014)。小鼠实验中当暴露的胚胎达到成年时，子宫内砷暴露（剂量从42.5到85 ppm）导致肺、肝、肾上腺、皮肤和卵巢肿瘤的发生率增加(Liu et al. 2007; Tokar et al. 2010; Waalkes et al. 2004b)。已知泌尿生殖系统是砷毒性的一个靶点：从胚胎第8天（E8）到E18，CD-1小鼠在子宫内暴露于85 ppm砷后，90周龄时卵巢、子宫和肾上腺肿瘤的发病率增加(Waalkes et al. 2006)。

虽然高水平砷暴露（百万分率范围）的有害影响已得到充分记录，但现在尚不清楚在正常人类可接受水平（十亿分率范围）下接触砷会产生什么后果。从胎儿期到成年期暴露在50 ppb砷环境下会增加雌性CD-1小鼠的肺癌发病率(Waalkes et al. 2014)，怀孕期间暴露在10 ppb砷环境下会导致肝脏脂肪变性，暴露于C57BL6/J的雌亲的母乳甘油三酯水平会降低，导致其后代的生长缺陷 (Kozul-Horvath et al. 2012)。本次研究中，本研究调查了10 ppb砷暴露[美国环保署（2001）指定的饮用水中的最大污染物水平（mcl）]对人类后代的影响。本研究将小鼠暴露于砷含量为42.5 ppm的饮用水中，以确定在已知肿瘤诱导水平下宫内砷暴露 (Tokar et al. 2010; Waalkes et al. 2003)对发育期到1岁的一般生理功能的影响。暴露时间限制在妊娠后半段，从E10到出生（小鼠胚胎器官形成的关键时期），之后不再暴露让动物正常发育到成年。本研究注重生殖和代谢终点，这是已知的暴露会产生的生理影响。

材料和方法：

动物和处理：

雌性CD-1小鼠，8-10周大 (Charles River, Wilmington, MA)与CD-1雄性交配。检测到阴道塞的那一天被认为是胚胎第0天（e0），怀孕的雌性被单独安置在塑料笼中，使用SANI Chipsreg;用品 (P.J. Murphy Forest Products Corp.)。孕鼠可随意获得NIH-31 食物 (Harlan Teklad, Indianapolis, IN)和经过反渗透去离子系统处理的水 (Hydro Service and Supplies, Inc., Durham, NC)。在NIH-31食物中砷低于可检测水平（通过感应耦合等离子体原子发射光谱分析；Microbac实验室）。在E10，孕鼠被随机分为以下治疗组（每组11名孕妇）：a组，对照组，无砷；b组，10 ppb无机砷（亚砷酸钠；光谱化学品，New Brunswick, NJ）；c组，42.5 ppm无机砷。在饮用水中加入砷。干预时间为E10到出生。怀孕雌鼠自然分娩，新生的幼鼠立即给未接触砷的雌鼠喂养。为了保证幼鼠的均匀生长，每只寄养雌鼠都从同一胎中获得10只幼鼠。雌性幼鼠被分配到表1所列的实验中。实验时间表如图1所示。所有的小鼠都在标准的塑料鼠笼中（每个鼠笼最多5只），房间的温度和照明受控（12小时亮：12小时暗）。小鼠通过吸入二氧化碳进行处死。所有动物程序均由国家卫生研究所动物培育和使用委员会批准，并按照批准的国家环境卫生科学研究所动物研究提案2012-0006进行。所有动物在减轻痛苦方面都得到了人道对待，并遵循了《实验室动物护理和使用指南》(Institute of Laboratory Animal Resources 2011)。

阴道开放和发情周期分析：

雌性幼鼠（对照组29只，10 ppb组37只，42.5-ppm组35只）从18天开始每天0900小时检查阴道开放状态，直到每只雌性幼鼠出现开放的阴道管。从10周开始，每天(0900 hours)在笼子中进行阴道涂片，连续18天监测雌性大鼠的发情周期。阴道涂片立即固定在玻片上（safetex；andwin scientific），并按照标准的Hamp;E方案用苏木精和伊红（hamp;e）染色。如前所述，根据阴道细胞学确定发情周期的阶段(Jayes et al. 2014)。

生育研究：

当雌鼠达到8周大时，每一只都进行持续的交配安排。雌性（对照组：n=5；10 ppb组:n=8；42.5 ppm组:n=13）和确定未接触砷的雄性（CD-1雄性，10-12周大）被安置在一起（每个笼子一对），直到它们1岁。1年期间分析的参数包括：第一胎的天数、两胎之间的天数、每胎的平均幼鼠数、每只雌性产生的幼鼠总数、每只雌性产生的幼鼠总数和生育期（以最初交配到最后一胎的天数计）。

体重和体脂成分的测量：

从断奶（21天）到15周大，每周给小鼠称重。生育研究中仅研究繁殖期开始之前的小鼠体重。8周龄以下小鼠体重测量的样本量，对照组为n=29，10 ppb组为n=37，42.5-ppm组为n=35。8-15周龄小鼠体重分析的样本量为：对照组n=17，10 ppb组n=25，42.5-ppm组n=21。在4.5个月大时，使用Piximusreg;密度计(GE Lunar Corporation, Waukesha, WI)分析未纳入生育研究的小鼠体内脂肪成分（对照组n=9，10 ppb组n=10；42.5-ppm组n=11）。

血液分析：

在不同时间点收集的血清中进行激素分析，不包括在生育研究。小鼠处死后，通过心脏穿刺或下腔静脉采集血液。血清（非禁食雌鼠采集）用BD微污染剂塑料毛细管采血器(BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ)分离并冷冻在-80℃。取21和28日龄雌性小鼠的血清，采用 Milliplex MAP Mouse Pituitary Magnetic Bead Panel（MPTMAG-49K；Millipore，Billerica，MA；对照组n=29；10 ppb组 n=37；42.5 ppm组 n=35）来测量小鼠黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的水平。使用6个月龄雌性小鼠的血清用小鼠代谢试剂盒[编号N45124A-1; MSD (Meso Scale Discovery), Gaithersburg, Maryland]测量瘦素和胰岛素水平，根据分组（对照n＝5；10 ppb n＝7；42.5 ppm n＝6）。用21天、28天、6个月和1岁的雌鼠血清，用多斑点96 Hb 4-点定制类固醇激素面板（目录号N45 CB-1；MSD）测量雌二醇、脱氢表雄酮（DHEA）、睾酮和孕酮水平。数据显示在补充材料图S3（对照组n=5；10 ppb n=5；42.5 ppm=6）中。所有样品均一式两份。

葡萄糖耐受试验：

不包括生育研究（对照组n＝7；10 ppb n＝10；42.5 ppm n＝11）的五个月大的雌鼠禁食过夜，并且使用NOVA MAXreg;加葡萄糖计 (Nova Biomedical, Waltham, MA)测定血清中的基线血糖水平。然后给小鼠腹腔注射d-葡萄糖（2 mg/g体重），并在注射后20、40、60、120和180分钟采集血液样本进行葡萄糖测量。

其他：

E18胚胎的体重分析如补充材料图S1所示（对照组n=46；10 ppb n=30；42.5 ppm n=38）。在出生后第21天和第28天以及6个月（对照组n=5–7；10 ppb n=5–8；42.5 ppm n=6–8，每个时间点）收集的动物卵巢在多聚甲醛（pfa）中固定过夜，并用Hamp;E染色。结果显示在图s2。

统计分析：实验的样本量如表1所示。采用对数秩统计和协方差混合模型分析，调整断奶体重和母畜效应，分析阴道开放时的年龄数据。采用混合效应方差分析法比较了四个阶段（发情前期、发情后期、间情期和发情前期）中每个治疗组所花费的时间百分比，其中DAM作为随机效应考虑相关性。采用Dunnettrsquo;s test比较各治疗组与对照组。以DAM为随机效应，采用混合模型方差分析（ANOVA）对体重和体脂组成进行分析，并考虑了相关系数。采用方差分析和图基多重比较试验比较激素水平和生育率数据。p值lt;0.05被认为具有统计学意义。

结果：

本研究的目的是研究在美国环境保护局（EPA）最大污染物水平（MCL；10 ppb）和肿瘤诱导水平（42.5 ppm）下，饮用水中砷的暴露情况（Waalkes等人2003年，2004年b）对子宫内暴露动物成年后的生殖和代谢功能的影响。本研究将暴露时间限制在妊娠后半期，以明确研究砷对器官形成的影响。怀孕的CD-1雌性小鼠暴露于砷中，对体重增加和每窝产下的幼鼠数量没有影响（见补充材料，图S1）。除10 ppb组外，E18组的胎儿体重相似，这表明体重显著增加（参见补充材料，图s1）。从暴露的雌性小鼠中出生的幼鼠看上去健康，没有任何压畸形的迹象，它们能够发育到成年进行生殖和代谢终局分析。

生殖发育：

雌性小鼠生殖发育的最初迹象之一是阴道开口，这是发育期开始的外部指标(Hansen et al. 1983)。对

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