微囊化技术：一种低温保存和增殖人类胚胎干细胞的有效工具外文翻译资料

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微囊化技术：一种低温保存和增殖人类胚胎干细胞的有效工具

摘要

人类胚胎干细胞（HSC）相关技术的应用，需要生产大量性能良好的有关细胞并将它们进行有效的长期存储。研究表明，将多能胚胎干细胞包埋于海藻酸盐微囊中能保护细胞免受冻存带来的损害，同时也能保证干细胞的正常增殖。对不同的三维（3D）培养方法进行评价和比较，尤其是将人类胚胎干细胞微囊化为：1）单细胞，2）细胞聚集体和3）固定于微载体上培养的三种不同方法。为了建立一个可扩展的生物过程，将人类胚胎干细胞微胶囊放在搅拌罐生物反应器中培养。微胶囊和微载体技术的结合为多能性胚胎干细胞的生产和存储提供了一个更高效的方案。这一方案确保了细胞冷冻保存之后的高增殖率（约二十倍增加细胞浓度）以及细胞冻存后的高复苏率（gt;70％）。与未被包埋的细胞相比，包埋细胞解冻后存活率提高了三倍，并能够维持人类胚胎干细胞的特征。微胶囊也通过保护细胞不受流体剪切应力的影响改善了胚胎干细胞聚集体的培育，同时能控制聚集体的规模并维持细胞多能性两周。这项工作证明微胶囊化技术将会成为一种多能胚胎干细胞整合增殖和冷冻保存的强大工具。在此开发的3D培养方法象征着人类胚胎干细胞在临床和工业中的应用已具有一定突破。

前言

人类多能干细胞、胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）共同组成了一个新兴领域。这些细胞具有能无限增长（自我更新）和分化成人体任何成熟细胞（多能性）的内在能力，这种能力对再生医学、组织工程、药物发现和毒理学都极具吸引力^[1]。然而，为了发展高质量治疗产品和功能筛选工具，必须要建立有效的方案以实现人类胚胎干细胞大规模的增殖、存储和分离。

胚胎干细胞通常在二维（2D）系统（ 即培养皿，孔板和组织培养瓶）^{[ 2 ]}中培养。近年来，传统二维培养体系在模拟干细胞体内环境时所表现出的不适用，是其在基础生物学和组织工程研究中一直存在的缺点^{[ 3 ]}。尽管细胞与细胞，细胞与基质之间的相互作用在类胚胎干细胞培养中扮演着很重要的角色，但他们目前还没有在这些二维系统中得到妥善处理。此外，与这些培养方法对应的其固有变异性，缺乏环境可控性，低生产量是阻碍干细胞进一步高效，大规模，低成本发展的主要缺点（综述^{[ 4 ]}）。细胞低温储存之后所表现出的低产量和不受控制的高分化现象^{[ 5 ]}也限制了二维系统在临床/工业中的应用。

研究者们为发展更为有效的人类胚胎干细胞培育系统已付出了诸多努力，即通过结合基于生物反应器的三维细胞组织培养方法，保证了操作简单、可测量和均匀的培育环境^[6,7]。根据最近研究显示，搅拌式生物反应器（旋转容器和环境控制的搅拌式生物反应器）在胚胎干细胞作为聚集体增殖和负载微载体方面得到了成功的使用 ^[6,7,8]。从临床/工业角度来看，这些系统仍然需要进一步改进，以增加在低温储藏过程中细胞增殖产量和确保有效的生物集成过程。事实上，搅拌培养容器经常对细胞应用机械力（混合和间或的灌注）， 这最终可能导致对细胞活力，形态，基因 表达和分化潜能的损害^{[ 9 ]}。在培育期间所观察到的过度聚合/微载体聚集是另一个令人关注的问题，因为它可能会导致形成坏死中心或促进自发分化，减少细胞增殖产率。此外，开发有效的冷冻保存方法能够保证在缺乏大规模增殖之后仍然能高效存储和运输。虽然聂等人报道了一种新的人类胚胎干细胞贴壁培养冷冻保存方法 ^{[ 10 ]}，但该方法仍需要进一步优化，以除去动物饲养细胞和改善细胞附着/解冻后存活率。

细胞微囊化技术是一个能够克服上述缺点的有效方法，因为保护细胞免受水力剪切作用，在允许有效营养物质，生长因子和气体通过微囊基质的同时还能防止细胞聚集体过度团聚^{[ 11 ]}。胚胎干细胞的培养可以使用多种水凝胶，其中包括藻酸盐^{[ 12 ]}，聚（乳酸-乙醇酸）/ 聚（L-乳酸）支架^{[ 13 ]}，琼脂糖^{[ 14 ]}、壳聚糖^{[ 15 ]}和透明质酸^{[ 16 ]}。海藻酸钠因具固有的良好生物相容性，生物安全性和渗透性而常用作封装材料^{[ 17 ]}。微胶囊化海藻酸钠细胞的生产可以在安全的生理条件（例如生理温度和pH值，使用等渗溶剂代替细胞毒性溶剂）^{[ 18 ]}下进行并使用良好生产规范（GMP）指南^{[ 19 ]}，这一特点使这项技术在细胞疗法方面有更好的应用。事实上，海藻酸钠微囊在移植胰岛细胞和其他分泌细胞及组织中的巨大潜力已经被报道^[20,21]。

我们课题组利用海藻细胞微胶囊来提高原代肝细胞的生存能力和功能性^[22,23]以及生物反应器中的干细胞或祖细胞分化成不同的细胞类型的能力^{[ 24,25,26,27,28 ]}。此外，我们最近证实，将细胞包埋在海藻酸钠微囊中是一种非常有价值的方法，这样可以提高神经球冷冻和解冻后细胞的活力和细胞膜的完整性。这是由于将细胞固定在水凝胶内可保护其不受冰结晶过程中的机械损伤并且降低了因细胞-细胞，细胞-基质接触而造成损害的风险^{[ 29,30 ]}。尽管有许多类型（干）细胞的成功案例，但对人类胚胎干细胞微胶囊研究的具体说明^{[ 12,25,31 ]}仍然有限。

本文报道了一个通过细胞微囊化技术将人类胚胎干细胞包覆于海藻酸钠中进行低温储存，并在解冻后进行增殖的高效生物集成过程。由于考虑到不同细胞-细胞，细胞-基质间的相互作用，因而评估和比较了不同方案，分别包括将1）单细胞，2）细胞聚集体和3）负载微载体包埋在微囊中。为了获得一个可扩展且简单的生物过程，将含有胚胎干细胞的微囊剂培养在搅拌生物反应器（旋转容器）内，待增殖后，将其冻存在离心管中。

原料和方法

胚胎干细胞饲养层培养

以人包皮细胞作为饲养层（HFF，ATCC 收集），将胚胎干细胞作为聚集体在静态系统中（6孔板）进行常规繁殖，用丝裂霉素C灭活，在DMEM-KO培养基（用20%体积比血清对Knockout ^TM-DME进行增补代替（KO-SR）、1%体积比MEN非必需氨基酸（MEM— NEAA），0.1毫克每分子2-巯基乙醇，2毫克每分子谷氨酸盐，1%体积比链球菌，0.5%体积比庆大霉素和10毫微克/毫升如前所述^{[ 2 ]}的碱性成纤维细胞生长因子。每隔10–12天，即当胚胎干细胞的菌落覆盖培育墙约75– 85%的表面积时，用Tryple ^TM Select对它消化吸收6–8分钟，将单细胞悬液转移到新鲜的灭活人包皮成纤细胞馈线上（分光比在1:4 -1:24之间）。培养液每1-3天更换一次。

细胞条件培养基的制备

为了保证条件培养基的生产，将小鼠胚胎成纤维细胞放在浓度为5.5times;10⁴细胞每平方厘米的无碱性DMEM-KO（0.5细胞/ 平方厘米）培养液中，并将培养液装在用凝胶包覆的T形烧瓶中对细胞进行灭活有丝分裂和种植。简而言之，每批灭活小鼠成纤细胞均在37度，5%体积比的CO₂（空气）和条件介质下培育10天。在对人类胚胎干细胞培育系统进行喂养前，先对条件培养基进行过滤，并供给10纳克/ 毫升 碱性成纤细胞培养因子和 0.1 纳摩尔每升的雷帕霉素。

微胶囊化胚胎干细胞

海藻酸钠。超纯MVG海藻酸钠在 1.1%（重量/体积）的浓度为0.9%（重量/体积）氯化钠溶液中制备^{[ 31 ]}。

微胶囊的形成。微胶囊是在气流速率为2-3.5升/分，气压为1巴的条件下，通过1毫升注射器在空气喷射发生器作用下将海藻酸钠细胞混合物注射成型制备得来^{[ 22,23,32 ]}。所产生的的封装微胶囊直径约500-700毫米。为了使超纯MVG海藻酸钠交联，用100毫摩尔每升氯化钙 / 10毫摩尔每升HEPES缓冲溶液调节 PH值至7.4。海藻酸钠微胶囊在被转移入培育系统之前要用0.9%（重量/体积）NaCl溶液和DMEM-KO培养液清洗两次。

海藻酸钠微胶囊的溶解。Ca² -超纯 MVG海藻酸钠用孵化的微胶囊螯合剂溶液在37摄氏度下溶解 （50毫摩尔每升EDTA 和 10毫摩尔每升HEPES在PBS中）5分钟^{[ 31 ]}。细胞用PBS洗两次，然后再在微生物培养基上培育以备进一步的分析。

胚胎干细胞的三维培育

图1描述了三维培养主要步骤的策略发展。

单细胞封装。在脱离二维静态培养之前，胚胎干细胞聚集体要用5微摩尔每升的Y-27632预处理一小时，

一种Rho激酶（ROCK）选择性抑制剂。用TrypLE选择解离聚集体后即得到单细胞悬液，并立即将其封装在不同浓度的海藻酸钠内（0.75 和3times;10 ⁶细胞/毫升海藻酸钠）。随即胚胎干细胞微胶囊被接种于125 毫升锥形内，在37度，5%CO₂且每分钟70转的转速条件下，培养在添加有10毫摩尔每升 ROCKi容积为15毫升的mEF-CM中。在所有测试条件下，细胞的接种速率都为5times;10⁶细胞/毫升.

人类胚胎干细胞聚集体的封装。人类胚胎干细胞是从2D静态培养物解离，并在1.5times;10⁵细胞/毫升的浓度下接种成为锥形单细胞。细胞在50毫升补充有10微摩尔每升ROCKI的mEF—CM中培育，培育条件为37度，5% 的CO₂供给并将其置于70r/min的搅拌强度下。在第二天进行封装，聚集体用5微摩尔每升的ROCKI预处理1 小时，然后转移到15毫升试管内，让他们沉淀并脱离培养基。加入海藻酸钠后，聚集体就被封装，并被转移到125毫升配备桨叶轮的微调容器内，45转/分条件下，在100毫升 mEF-MC中再培养16天。每周三次通过停止搅拌（以诱导微胶囊沉积）对培养基进行部分替换，除去培养基的50％，并用新鲜培养基的50％进料代替。 未封装集合体培养物也并行执行，并用于控制目的。对整个实验过程中两种培养细胞存活，代谢活性，聚集体尺寸，浓度和组合物进行了监测。对于流式细胞仪分析，聚集体被转移到明胶涂层表面，也就是细胞能够迁移的mEF-CM。2-3天后，将细胞用TrypLE进行选择解离，并使用下文所述的协议处理用于流式细胞分析。

图1.用于胚胎干细胞增殖和冻存的3D微囊化培育方法的主要步骤

微胚胎干细胞固定封装。胚胎干细胞以4.5times;10 ⁵细胞/毫升的浓度被接种于体积为125ml，内含有Cytodex3 ^TM桨翼的旋转容器中（2克/升）。该微载体是根据制造商的建议制备和灭菌的，并涂有如文献^[7]中描述的Matrigel。细胞在25毫升补充有10微摩尔每升 ROCKi的mEF-CM中培养，在37度，5%CO2，离心容器间歇性搅拌条件下放入培育箱内。6小时后，向培养基中加入新鲜的mEF-CM并将搅拌速度设置为24rpm。直到第3天，在最后一个100毫升溶液中加入更多的媒介。 在第6天完成包埋；将涂覆有空微载体（1或2克/升）的基质胶在包埋前1小时加入到该培养基内。在此期间，将培养物用5毫摩尔每升的ROCKi处理。包埋后，将人类胚胎干细胞转移到微调试管内，在相同条件下再培育13天。每天将50%的介质进行替换。还进行并平行作为控制运行非包埋细胞 - 微载体的培养物。并监测这两种细胞浓度，活力和培育成分随着时间推移的变化。

在微载体和胚胎干细胞培养的膨胀过程结束时，微胶囊溶解，使用上述方法（人类胚胎干细胞的本条微囊），人类胚胎干细胞团块解离并接种在灭活hFF的胚胎干细胞单层顶端来进一步评估细胞多能性。

细胞低温储存

从微调试管中获得未包埋和包埋的胚胎干细胞的培养物，采用慢冻率的冻存方法^[30]。在培养的第13天和第14天，对人类胚胎干细胞微载体和聚集体进行收集，如（图1），所有的样品冻存之前用5毫米的ROCKi预处理1小时。

冷冻。在冷冻过程中，待微胶囊沉积后，除去培养基并加入冻存培养基（90％KO-SR，10％（体积/体积）DMSO。然后将细胞悬浮液转移至冷冻管（1毫升/瓶）中。使细胞在冷冻保存介质中平衡在4摄氏度20分钟。样品在基于异丙醇-冷冻系统中以每分钟1度的降温速率冷冻至零下80摄氏度，并储存在液氮中，直到气相的解冻。

解冻。储存后，细胞在37摄氏度水浴离心管中迅速解冻；随后立即用mEF-CM进行逐步稀释（1:1， 1:2、1:4）以淡化DMSO降低渗透压休克^{[ 30 ]}。 细胞微囊被转移到培养皿中培养 在辅以5毫摩尔每升 ROCKI的mEF-CM中培育9天。 每天进行介质更换。在9天，微胶囊溶解，用TrypLE选择分离胚胎干细胞团块；将人类胚胎干细胞转移到灭活hFF的hESC单层培养，用于后续解冻生长和分化潜能的研究。

解冻后的胚

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