土壤中氨氮浓度对N2O释放的影响以及对土壤中氨氧化菌和反硝化菌的群落结构的影响外文翻译资料

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土壤中氨氮浓度对N₂O释放的影响以及对土壤中氨氧化菌和反硝化菌的群落结构的影响

Sharon Avrahami, Ralf Conrad, and Gesche Braker*

Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology, Karl-von-Frisch-Strasse, 35043 Marburg, Germany

Received 30 May 2002/Accepted 6 August 2002

摘要：添加氨氮（为6.5，58以及395微克的NH₄ -N的含量(g)【干重】）对土壤中微生物群落的影响仍在探索中。将样品放在4℃下，并添加中高含量的氨浓度培养5天，发现N₂O排放的速率增加，说明氨的添加对硝化作用作出了贡献，使N₂O的排放增加。通过将氨氧化古菌基因编码中氨单加氧酶的小亚基放在具有一定梯度的变性剂的凝胶中电泳（DGGE技术），培养4周后再去分析氨氧化菌落。无论土壤是否未经处理或用低，中或高含量的氨浓度进行培养,得到的DGGE指纹图谱总是相同的。通过对使用DGGE技术分离的PCR产物进行系统地分析，检测到amoA序列可能属于Nitrosospira（亚硝化螺菌属） 16S rRNA的第3和第4簇。其他的克隆子与Nitrosospira sp. 的Ka3和Ka4菌株聚集在一起，并且有一种氨单加氧酶基因（amoA）簇是来自未知的物种。仅在一个克隆子中检测出Nitrosospira属的amoA基因。运用末端限制性片段分析技术（T-RFLP）得到整个菌株的剖面图谱与amoA的结果并无巨大差异。然而，在中高含量的氨浓度下培养反硝化菌落，通过T-RFLP分析技术分析亚硝酸盐还原酶中的nirK基因，发现反硝化群落出现了转移。在环境样本中观察到的主要限制性片段是通过与来自相同土壤的对应克隆nirK基因进行比较之后再进一步描述。通过系统发育分析后，我们可以将这些克隆子编组到土壤中的nirK基因簇中。而且，一些克隆与已知的反硝化细菌密切相关。这些反硝化细菌群落的转变可能是因为增加了硝化作用中氧化氮的供量。硝化活性在添加氨时增加，但是氨氧化菌的群落结构没有变化。

N₂O是硝化作用中的副产物也是反硝化作用中的中间产物（9）。环境中N₂O的生成和排放加剧着全球变暖（11），并且会破坏平流层臭氧层（10）。大气中70%的N₂O的是来自土壤中微生物过程的排放（9）。来自土壤中的N₂O排放会随着农业中氮肥的施用量增加而增加（37）。在实验室中（36）和实地研究（25）都可以发现在硝化作用中氨浓度的增加会使总N₂O的产生增加，说明施加氨肥会中土壤中硝化细菌活性增加。但是，还不能确定施肥是否会引起细菌群落结构发生变化，因为这样的变化只在把硝化过程中的矿物肥料换成废水之后才会发生（28）。虽然实地研究清楚地表明，不同土壤中氨氧细菌的群落结构可能不同（见下文），但是很少有实验去研究硝化细菌种群的原位动态是否存在（23,29）。

主要通过研究靶向16S rRNA基因来研究土壤中好氧氨氧化硝化细菌。在纯培养环境下培养的氨氧化物包含两个单体组（31）。一组属于Proteobacteria类的gamma;亚门，已知的大肠杆菌和嗜盐球菌就是属于这一组。另一组属于Proteobacteria类的beta;亚门，包括两个属：亚硝化单胞菌和亚硝基螺旋菌属。根据16S rRNA基因序列将属于beta;-Proteobacteria细菌的氨氧化细菌和克隆可以至少分为7个簇（31,39）。土壤中主要包含了硝化菌属的2，3和4簇(8, 17, 29, 38)。氨氧化细菌16S rRNA克隆子的菌落模式取决于土壤酸度，其中硝化菌属的第二簇菌落结构必须在低PH的土壤中才能保持(21, 38)。另一种影响菌落结构的因素是氨浓度，硝化细菌的第3簇在含有较高氨浓度的早期土壤演替中起主导作用，而硝化细菌的第2簇和第4簇在含有较低氨浓度的晚期土壤演替中起主导作用(8, 20, 21)。添加有机化肥或者混合化肥的土地测得含有大量的额外硝化细菌种群(14, 18)。草原土壤的管理也影响这氨氧化细菌的种群，未经过改良的土壤中含有种类更加丰富的氨氧化细菌群落（40）。可以添加氮肥主要是硝化细菌的第3簇和第7簇的作用来改善土壤（40）。

所有的耗氧氨氧化细菌的关键酶均为氨单加氧酶。氨氧化古菌（amoA）酶的亚基基因编码可以很好地反映氨氧化细菌的系统发育，所以常被用来作为环境研究的有效靶标（2,31,33）。尽管amoA基因对于所有的氨氧化细菌都是具有特异性的和通用性的，但是amoA基因还没有像用16S rRNA基因去研究土壤中的氨氧化细菌一样被广泛使用(19)。通过借助靶向nirK基因（5）和16S rRNA基因，可以研究并比较脱氮菌群和总细菌群落的结构的区别。NrK基因编码含铜亚硝酸盐还原酶。NirK和含有cd1细胞色素的亚硝酸还原酶（NirS）虽然从结构上来看功能相同，但是是不同脱氮过程需要的关键酶。亚硝酸还原酶基因是反硝化细菌的功能标记基因，且这种生理组在系统发育不相关的群体中是普遍存在的。两种基因都被用于检测环境样品中的反硝化菌。在最近的一项研究（30）中表明，基于PCR检测技术，发现nirK主要存在于土壤中，而nirS主要存在于海洋沉积物中（6）。通过克隆两个基因（6,30）和运用末端限制性片段分析技术（T-RFLP）分析来自环境样品中的nirS基因（4）来分析反硝化细菌的群落结构。在本研究中，将介绍基于nirK基因的T-RFLP的群落结构分析。

我们的研究目标是测试土壤中氨浓度的变化将会如何影响氨氧化细菌的活性和结构与其他土壤细菌，特别是反硝化细菌。

材料和方法

土壤样品

Gouml;dde和Conrad（13）使用的泥土样品采用土壤上层10cm深度，来自德国Eberstadt (50°28.933′N,E8°45.930′)，2000年4月。将土壤放置在环境空气中干燥至只剩12.5％的含水量，滤掉le;2mm的聚集尺寸的土壤颗粒，并放在4℃温度下储存。采用比色法来测定氨浓度（16）和硝酸盐浓度（34）。测定0.01MCaCl₂和水的PH值，分别为5.8和6.1。土壤的含水量和最大持水量采用标准协议测定（34）。在每个实验开始时，再将土壤的持水量调整为60％。

N₂O释放实验装置

Gouml;dde和Conrad（13）对实验的描述略有修改。由于原始土壤中氨浓度非常低，(每土壤中含有0.19 微克NH₄ -N g [干重] )，所以往土壤中加入铵。为了研究添加氨对土壤的影响，选取三种不同浓度的氨添加到土壤中，分别是每土壤中含有6.5、58、395微克NH₄ -N g [干重]，并放在4℃下进行培养。培养5天后再测量土壤中的氨浓度。使用之前已经描述过的电子捕获检测器Carlo Erba 8000气相色谱仪来测量N₂O的释放（13）。准别一份添加10Pa的乙炔的样品，和一份没有添加乙炔的样品，进行预培养之后测量硝化作用对N₂O释放的贡献，结果和之前预想描述的一样（13）。

分子分析

准备三种含有低，中，高氨浓度的样品（分别为LA,MA,HA），放置在4℃下培养四周。打开含有5g土壤的120ml血清瓶，每3天通气10分钟，以保持它的有氧条件和稳定的含水量。每次将约500mg（湿重）的土壤先转移到2ml螺旋盖管中在进行处理。此外，在进行培养之前，要先取样（ZT）作为参考。

DNA提取

根据Luuuml;demann等人的提取DNA方案（22）稍作修改从这些样品中提取DNA。把每个样品与750mu;l的磷酸钠缓冲液（120 mM; pH 8）和187mu;l的十二烷基硫酸钠溶液（10%的十二烷基硫酸钠，0.5M Tris-HCl缓冲液[pH 8], 0.1M NaCl）。通过离心将样品均匀分层。在60℃下将溶液培养10分钟后，加入0.5g玻璃珠（0.17-0.18mm直径），将悬浮液放入研磨机中以最大速度振荡1分钟（Dismembrator-S研磨机; B.Braun Biotech，Melsungen，Germany）。经过离心后（10分钟，20,817*g ， 4℃），收集上清液，并用苯酚（pH8），苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1;pH8)和氯仿-异戊醇（25:24）萃取三次。加入乙酸铵溶液（最终滴定浓度为2.5M）和相等体积的冷异丙醇，然后在-20℃下离心（20分钟，20,817*g ，4℃），直到DNA沉淀。随后，用80％乙醇洗涤沉淀后的DNA，再进行离心（5分钟，20,817*g ，4°C），并在真空下干燥。最后，用100mu;l的TE缓冲液对DNA进行再悬浮（10mM Tris base，1mM EDTA，pH8）。根据Henckel等人（15）所述的方案，使用聚乙烯聚吡咯烷酮柱，从腐殖酸中提纯DNA。通过对比260nm和280nm波段处的吸光度，得到结果的比为1.49〜1.82（n=6），所以判断DNA的纯度较高。

amoA的PCR扩增

用于PCR扩增的引物是由Rotthauwe等人先前描述过的amoA组（33）。对于使用变性梯度凝胶电泳分析技术（DGGE），先将之前Muyzer等人（26）所述的鸟苷-胞嘧啶夹钳加到上游引物的末端5′处。每种引物使用0.5mu;M，以及1 U 的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt,Germany，聚合酶的来源)，25mu;l含有100mM Tris-HCl溶液（pH 8.3）的MasterAmp 2*PCR premix F试剂，100 mM KCl, 7 mM MgCl₂ , 400 mu;M的脱氧核苷三磷酸，PCR增强甜菜碱（Epicenter Technologies，Madison，Wis）。由于腐植酸抑制作用的原因，需将DNA稀释10倍，1mu;l的试剂最终滴加至50mu;l。将PCR管置于Mastercycler Gradient热循环仪（Eppendorf，Hamburg，Germany）中已经预热好的（94℃）热块中开始扩增。再使用了Rotthauwe et al（33）之后可以将扩增程序优化，94℃预变性5min,94℃变性45s,60℃退火30s,72℃延伸1min，最后于72℃再延伸6min。

DGGE技术和克隆amoA

对如前所述的DGGE稍微进行修改（26）。从45%-65%梯度的聚丙烯酰胺凝胶中分离出PCR产物，45%的凝胶 (6% [wt/vol] 超纯丙烯酰胺(acrylamide)和亚甲基双丙烯酰胺(bisacrylamide) [37.5:1;Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany],18%的去离子甲酰胺，3.1 M 的尿素)，65%的凝胶（6％[wt/vol]丙烯酰胺-双丙烯酰胺[37.5：1; Bio-Rad]，26％去离子甲酰胺，4.5M尿素）。在100V和60℃下，使用含有0.5*Tris-acetate-EDTA的D基因系统（Bio-Rad）对凝胶进行17个小时的电泳。将凝胶用1:50000（vol / vol）SYBR Green（Biozym，Hessisch-Oldendorf，Germany）染色，并用Storm 860磷光成像仪（Molecular Dynamics，Sunnyvale，Calif。）进行检测。

使用Dark Reader透照器（Clare Chemical Research，Ross on Wye，United Kingdom）从DGGE凝胶中切下条带。将切除的条带悬于200mu;l的PCR水中，重新扩增，然后再次使用DGGE分离。由于每个样品中出现多个条带，将来自切除条带的再扩增PCR产物连接到pGEM T-Easy载体上（该载体是根据制造商[Promega，Madison，Wis]提供的方法大肠杆菌JM109转化为感受态细胞）。使用DGGE特异性引物重新扩增含有正确插入片段的克隆，再通过比较克隆、环境样品、实验样品，最后进行筛选。用amoA引物重新扩增后的不同的克隆类型将按照此描述步骤进行测序。

细菌和反硝化菌的群落分析

对于16S核糖体DNA（rDNA）的扩增，根据Luuml;demann等人（22）之前提出的针对amoA的方案进行修改后，即可变成用来提取土壤样品中的DNA方案。稀释了10倍的提取物的DNA（1mu;l）将用于根据别处（4）所述的具有细菌16S rDNA引物8-27F [5′-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3′]的PCR产物（50mu;l），以及Amann等人（3）描述的1392-1407R (5′-ACGGGCGGTGTGTACA-3′)，和C. L. Moyer（夏威夷大学，海洋与地球科学技术院）的实验样品（未发表结果）。对于nirK，将使用FastDNA土壤旋转试剂盒（BIO101，Carlsbad，Calif）来提取DNA。根据别处地方（6）所述的方法，用1mu;l的2倍稀释的DNA提取物来合成PCR产物（50mu;l）。对于T-RFLP，用6-羧基荧光素标记细菌前体16S rDNA引物和反向nirK引物的末端5处，之后将会使用到2mM浓度的已经被标记的nirK引物。使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）将三个PCR产物合并和纯化。将纯化的PCR产物（100ng）用3U的 HhaI（限制性内切酶）（Promega，Mannheim，German

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