姜黄素诱导人胰腺癌细胞自噬，凋亡及细胞周期阻滞外文翻译资料

姜黄素诱导人胰腺癌细胞自噬，凋亡及细胞周期阻滞

摘要：目的：姜黄素是姜黄的活性提取物。这项研究的目的是确定姜黄素对PCa细胞的作用机制和自噬在这个过程中的作用。方法：CCK-8法检测姜黄素对PANC1和BxPC3细胞生长的抑制作用，通过流式细胞术测试细胞周期分布和细胞凋亡，自噬体通过细胞免疫荧光测定进行测试，Western blot检测蛋白表达，分析LC3II/Bax与细胞活力的相关性。结果：姜黄素以剂量和时间依赖性方式抑制细胞增殖。姜黄素可诱导PCa细胞的G2/M期细胞周期阻滞和细胞凋亡。在剂量组中检测到自噬体，Bax和LC3II蛋白表达上调，而在姜黄素的高剂量组Bcl2表达下调。LC3II / Bax与细胞存活率呈现着负相关。结论：自噬可能由姜黄素治疗胰腺癌引发。细胞凋亡和细胞周期阻滞也参与了这个过程。这些发现意味着姜黄素是PCa细胞的多靶点药物。另外，在高浓度姜黄素组中，自噬性细胞死亡可能占优势。

正文：

在美国，胰腺癌（PCa）是第三位癌症相关死亡的主要原因，其5年生存率为7.7％[ 1 ]，在所有癌症发病率中排第12位。近81％的PCa患者在末期被诊断，这预示着不良的预后。根据一些统计数据，前列腺癌的发病率和死亡率继续上升，而大多数其他癌症的发病率和死亡率下降[ 2 ]。手术仅适用于少数早期患者，化疗是转移性癌症患者最重要的补救措施。术前和术后化疗也可以使患者受益。根据一项随机研究[ 3]]，对5-FU治疗与吉西他滨治疗的患者进行调查，中位生存期从5-FU治疗的4.41个月增加到吉西他滨治疗的5.65个月，1年生存率从5-FU治疗患者的2％提高到吉西他滨治疗患者的18％。吉西他滨治疗因此成为一线的化疗方案。但是由于药物的多重耐药性和药物导致的难以忍受的不良反应，寻找新的替代化疗药物和辅助化疗药物成为当务之急。

几十年前就提出了自噬的概念来描述许多生物体中广泛存在的“自我进食”现象[ 4 ]。这是一个降解细胞质成分，尤其是蛋白质对营养缺乏和压力等恶劣条件反应的过程。最近的证据表明，自噬在肿瘤发生和转移中是一把双刃剑，因为它可以抑制肿瘤的形成，但另一方面，一旦肿瘤形成，它会促进肿瘤生长[ 5 ]。一些研究[ 6，7]表明，自噬抑制能够明显削弱PCa活性。mTOR（雷帕霉素的机制目标）具有丝氨酸/苏氨酸激酶，并作为细胞生长和代谢的重要调节因子[ 8 ]。在正常条件下，mTOR总是抑制ULK1-Atg13-FIP200复合物并阻断自噬，而当mTOR活性在营养缺乏或压力状态下被抑制时，则出现自噬[5，9]。该途径可以触发自噬体的形成。同时，LC3-I通是过从LC3中除去C-末端22个氨基酸而形成的，随后又将一些LC3-I转化为LC3-II，从而导致自噬体的成熟和分离。LC3-II的量与自噬体形成的程度呈正相关，因此可以认为是自噬的一个很好的标记[ 10 ]。

姜黄素作为姜黄的一种成分，由于其多种生物效应，包括抗炎[ 11 ]，抗氧化[ 12 ]和抗癌[ 13 ]特性，已经引起越来越多的关注。姜黄素从属于姜科的姜黄的根茎中提取，化学上称为1,7-双 - （4-羟基-3-甲氧基苯基） - 庚-1,6-二烯-3,5-二酮。化学式为C21H20O6[ 13，14 ]。大量的体外和体内实验表明，姜黄素能通过诱导细胞凋亡抑制胃癌，卵巢癌和结直肠癌等各种癌症的发展[15 - 17 ]或单独抑制细胞增殖[ 18 ]。此外，近年来的一些研究表明，自噬在姜黄素的抗癌过程中起着一定的作用[ 19 - 21 ]。但是，其潜在的机制仍然是难以捉摸的和有争议的。本研究的目的是确定自噬是否在姜黄素治疗PCa中发挥作用，并探讨其机制。

2、材料和方法

2.1细胞系和试剂

PANC1和BxPC3细胞系作为人胰腺癌细胞系的代表，其中PANC1细胞来自导管上皮细胞，BxPC3细胞来自腺泡状腺癌。另一方面，人源细胞系比动物来源更接近临床药效。两者均购自中南大学湘雅细胞中心（中国长沙）。PANC1细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，BxPC3细胞在RPMI 1640培养基中的培养，并于37℃在5％CO₂中保存。两者均供应10％胎牛血清（FBS）。将姜黄素（P0206，纯度gt; 98％，购自PureOne Biotechnology，Shanghai，China）用DMSO以100mg / ml配制成液体，然后用培养基稀释成不同的所需浓度。

2.2细胞生长抑制试验

将细胞接种在96孔板中，每孔10^4个细胞。细胞贴壁后加入不同浓度的姜黄素。起初，PANC1细胞用姜黄素在0，0.2，2，10，20，40，80，和200mu;g/ml浓度处理24小时。据发现，在0,0.2,2和10mu;g/ ml的浓度下细胞形态和增殖状态没有差异，但是当浓度为20thinsp; mu;g/ml时，细胞增殖开始受到抑制，细胞形态从正常梭形和多角形变为圆形，细胞间的触角开始减少。随着培养浓度的增加，细胞碎片逐渐增多，细胞增殖受到明显抑制。当孵育浓度达到200thinsp; mu;mu;g/ml，几乎只有细胞碎片。因此，选择0,10,20,40和80mu;g/ ml的浓度来研究PANC1细胞的细胞增殖速率，并且类似的，BxPC3细胞用0，0.4，0.8，1，4，8， 10和thinsp; 20mu;g / ml浓度的姜黄素处理。培养时间设定为24,48和72小时。细胞活性通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8，DOJINDO，日本）在450nm吸光度测试。

根据研究结果，各组分别设定如下：用0，10，20，40和80mu;g/mlthinsp;浓度的姜黄素处理PANC1细胞和0，0.1，0.5，1，5和10mu;g/ml的姜黄素处理BxPC3细胞在下列实验中，其中thinsp; 0mu;g / ml组为对照组。培养时间设定为24小时。

2.3细胞周期分析

收集如前所述的不同组的细胞并用PBS洗涤并在4℃下用75％乙醇固定过夜。用PI / RNase溶液（BD Pharmingen，550825）在黑暗中染色15分钟后，通过流式细胞术（Becton Dickinson，USA）检测不同组的细胞周期分布。

2.4细胞凋亡定量检测

如前所述用不同浓度的姜黄素处理后将两种细胞系用胰蛋白酶消化，并用PBS洗涤三次。操作程序参照指令进行。细胞用PI（Propidium Iodide）/ Annexin V-FITC试剂盒（日本DOJINDO）进行双重染色。所有样品都使用BD流式细胞仪检测。凋亡数量定义为Q2和Q3象限的总和。数据和图表用FlowJo 7.6软件处理。

2.5免疫荧光分析

在这项研究中，我们使用LC3来检测自噬。在24孔板中用不同浓度的姜黄素处理后，细胞用多聚甲醛固定15分钟，并与LC3抗体（Cell Signaling Technology，＃12741）一起孵育过夜。第二天，用FITC（荧光染料）结合的第二抗体用荧光显微镜检测LC3。

2.6蛋白质印迹试验

通过细胞裂解，超声处理和离心得到的蛋白质[ 22 ]装载到每个孔中，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5％脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与4℃下一抗孵育过夜，包括抗LC3（1：1000），抗caspase 3（1：1000，CST，＃9663） 抗mTOR（1：1000，CST，＃2983），抗Bax（1：1000，CST，＃2772S），抗Bcl2（1：1000，CST，＃2870S），抗beta;肌动蛋白（1：5000 ，KeyGEN BioTECH，KGAA001，江苏）和抗alpha; - 微管蛋白（1：1000，CST，＃2144S）。然后，将膜与第二抗体（山羊抗兔IgG-HRP）在室温下在摇床上孵育1小时。最后，采用Tannon 5200自动成像系统（中国上海）通过ECL测定法（KeyGEN BioTECH，中国江苏）观察条带，并使用Tannon GIS图像分析系统测量光密度（OD）。

2.7统计分析

用SPSS 22.0软件计算细胞活性与LC3II / Bax的相关性。其他统计分析结果由GraphPad Prism 5软件完成。使用单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验来确定组间差异。p值lt;0.05被认为是统计学上差异显著。

3.结果

3.1姜黄素抑制PCa细胞增殖

姜黄素对PCa细胞系的抑制作用呈剂量和时间依赖性。如图1所示，纵坐标的450nm处的吸光度表示细胞活力。至于PANC1细胞（图1（a）），在40thinsp;mu;g/ml浓度孵育48小时和72小时组比24小时组细胞活力显著下降，和20mu;g/ml的细胞增殖在72小时组被抑制超过24小时组。而且，随着药物浓度的增加，各孵育时间组细胞活力逐渐下降。姜黄素对BxPC3细胞发挥类似的剂量和时间依赖性抑制作用（图1（b））。它们分别为浓度为4thinsp; mu;g/ml孵育48个小时组和浓度为0.8，1和4thinsp; mu;g/ml孵育72小时组与24小时组比较有显著差异。姜黄素浓度越高，细胞活力越低。

图1：姜黄素以时间和剂量依赖性方式抑制PCa细胞的增殖。（a）随着培养时间和浓度的增加，PANC1细胞系的细胞活力下降。（b）在BxPC3细胞系中发现了类似的抑制作用。

3.2姜黄素诱导PCa细胞周期阻滞

如前所述，PANC1细胞用0，10，20，40和80thinsp; mu;g/ml的姜黄素处理24小时，和BxPC3细胞用0，0.1，0.5，1，5和10mu;g/ml的姜黄素处理24小时。PCa细胞周期在G2 / M期停滞（图2，3）。0,10,20,40和80mu;g/ ml组的G2/M期平均比例依次为PANC1细胞的18.1％，19.6％，28.8％，39.1％和37.6％（图2）。与对照组，细胞周期在40和80mu;g/ml组中显著阻断（图2（b））。0,0.1,0.5,1,5和10mu;g/ ml组BxPC3细胞的G2/M期平均比例分别为14.9％，15.6％，15.2％，12.7％，15％和29.9％（图3）。10 mu;g/ml处理组与对照组有显著差异（图3（b）中）。结果提示姜黄素阻断PCa细胞G2/M期。

图2：姜黄素诱导PANC1细胞G2 / M期阻滞。（a）通过流式细胞仪检测细胞周期分布。（B）G2 /M期的比例在40和80mu;g/ml处明显增加thinsp;。每个数据集代表三个独立的实验。

图3：姜黄素诱导BxPC3细胞的G2/M期阻滞。（a）用不同浓度的姜黄素处理后的BxPC3细胞的细胞周期分布。（b）G2 /M期的比例在10mu;g/ml处明显增加。

3.3姜黄素诱导PCa细胞凋亡

3.3.1流式细胞仪检测姜黄素对细胞凋亡的影响

0,10,20,40和80mu;g/ml组PANC1细胞凋亡率分别为2.3％，2.8％，9.9％，55.6％和90.3％（图4）。右下（膜联蛋白V / PI-）和上（膜联蛋白V / PI ）的象限的总比例表明80mu;g/ml组细胞凋亡水平高于对照组（图4的（b））。对于BxPC3细胞，0,0.1,0.5,1,5和10mu;g/ml组的凋亡率分别为4.7％，5.1％，4.8％，6.5％，36.6％和74.6％（图5）。而10mu;g/ ml组与对照组有显著性差异（图5（b））。与细胞周期分布图像一致，我们可以看到40和80mu;g/ ml组的PANC1细胞及5和10mu;g/ ml组的BxPC3细胞的凋亡峰。

图4：通过流式细胞术测量姜黄素诱导的PANC1细胞凋亡。（a）每个图由四个部分组成，代表细胞的不同生存状态。右下（膜联蛋白V /

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[280737]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word