姜黄素经保护性自噬诱导肾小管上皮细胞凋亡而抑制生长外文翻译资料

姜黄素经保护性自噬诱导肾小管上皮细胞凋亡而抑制生长

YING WEI 1-3 ,JIAQI GAO 1-3,LINGLING QIN 2,3,YUNLING XU1-3,HAOXIA SHI 1-3 ,LINGXIA QU 1-3 , YONGQIAO LIU 1-3 , TUNHAI XU 1-3 and TONGHUA LIU 2,3

北京中医药大学药学系，教育部卫生重点实验室，北京中医药大学卫生重点实验室。

摘要：肾小管细胞凋亡和肾小管功能障碍是导致糖尿病的重要过程。了解肾小管上皮细胞生长的内在机制有助于预防与糖毒性有关的肾脏疾病。有研究发现姜黄素具有抑制细胞凋亡的作用。但是姜黄素对肾小管上皮细胞的作用尚未明确。目前研究通过几种复合生化试验发现晚期糖基化及其终产物（AGE）诱导了肾小管上皮细胞的毒性，其中包括了NRK-52E小鼠肾小管上皮细胞系的细胞生长、细胞自噬和细胞凋亡。用AGE后续处理NRK-52E小鼠肾小管上皮细胞发现自噬显著增加。研究结果也发现经phosphoinositide3-kinase/AKTserine/threonine kinase信号通路，姜黄素会表现出相反的效果而促进凋亡。这些结论推测出姜黄素在被AGE处理时会表现出肾保护性作用，至少在NRK-52E细胞中表现出促调亡。总体上来说，这些发现说明姜黄素，不仅有肾保护作用，也可以作为对糖尿病的一种新颖的治疗方案。

关键词：自噬、调亡、AGEs，姜黄素、糖尿病性肾病

1. 介绍：

糖尿病肾病(DN)以前被称为特发性结节性肾小球硬化，它是导致末期肾病的主要原因。它的特点是血压升高，尿白蛋白增多和肾小球病变，从而导致肾小球滤过减少，这是糖尿病(DM)(1，2)的主要微血管并发症。有很多机制被认为参与了病变，包括了非酶的糖基化，多醇途径理论和蛋白质激酶C理论。其中，最被广泛认可的假说是非酶的糖基化。在长期高血糖的状态下，机体内的葡萄糖分子和蛋白质会发生非酶的糖基化反应，产生晚期糖化终产物（晚期糖化和糖基化终产物，AGEs），这些产物会导致疾病的发生。有许多的研究已经证实了排除了AGEs的暴露会减少肾损害，抑制糖尿病并发症的进展并促进肾细胞的再生，但是有很少研究关注这些问题。在细胞和动物模型中已经研究和测试了包括AGEs抑制剂、PKC抑制剂在内的一些潜在的肾素疗法的潜在靶点，所以糖尿病肾病的发展仍然是一个主要的问题。因此，更多有关糖尿病的特定的病理生理机制应该被发现和鉴定，有助于发展这些危害性疾病的新疗法和策略。

先前的研究发现，AGEs可能导致细胞凋亡和管状细胞功能紊乱可能是肾小球超滤过的部分原因，肾小球超滤过是一种早期的肾功能障碍，会发展为晚期的肾小球硬化。自噬和凋亡有着很复杂的交互作用。在各种应激的刺激下包括饥饿，缺氧和ER压力下， 细胞凋亡和自食在同一细胞内同时发生。目前研究已经发现在AGEs处理下自噬和凋亡之间的关系。姜黄素能否减少AGEs诱导的细胞凋亡以及自噬在这发展过程中起的什么作用。此外，还有是否姜黄素在应答AGEs 时，会通过自噬途径对细胞起保护作用。

1. 材料和方法：

姜黄素；AGEs，Triton X‑100, DMSO, LY294002 and 3‑methyladenine (3‑MA)购于Sigma‑Aldrich（德国达姆施塔特市默克公司）；DMEM和FBS购于HyClone (美国犹他州洛根市赛默飞世尔科技股份有限公司)；Anti‑GAPDH, anti‑bax, anti‑AIF, anti‑caspase-3 和 anti‑p‑AKT购于美国德克萨斯州德州达拉时圣克鲁兹生物技术公司；Anti‑Beclin 1和anti‑LC3购于Cell Signaling Technology股份有限公司（美国马萨诸塞州贝弗利市）；ECL染色试剂盒购于（赛默飞世尔科技股份有限公司旗下Pierce公司 ）；流式细胞分析仪（美国新泽西州富兰克林湖贝迪公司）；所有使用的试剂用于探索分子分析,所用的水为蒸馏水。

1. 细胞培养

小鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E购于ATCC公司（美国弗吉尼亚州马纳萨斯市），细胞培养于10％FBS 4mM谷氨酸 1％青链霉素双抗 DMEM 培养基的培养液，置于5％CO2培养箱内培养，每孔6x10³个细胞。

1. 细胞活性

使用3‑(4,5‑dimethylthiazol‑2‑yl)‑2,5‑diphenyltetrazolium bromide（MTT）试验来检测细胞活性。具体来说，在样品中添加10ulMTT（500ug/ml），然后继续在37˚C恒温箱培养3h。接着去除MTT液，添加100ulDMSO用于稀释彩色甲臜晶体。每个孔的吸光度用酶联免疫监测仪 (Tecan Group Ltd., Mauml;nnedorf, Switzerland）在490nm处测量。细胞活性可用信号的比值来确定。通过流式测量仪测定细胞凋亡和末端尿苷3端标记(TUNEL)测定。我们用被FITC所标记的V膜联蛋白来检测细胞凋亡。采用碘化丙基碘来测定细胞坏死。在暴露于许多实验条件下后，细胞被胰蛋白酶化，在37˚C用荧光标记物标记，然后用细胞荧光法进行细胞荧光分析。细胞自噬也可用用TUNEL法来测量。为了进行TUNEL试验，细胞被覆盖物遮住在各种实验条件下进行预处理。通过荧光显微镜(Leica TCS SPE; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)，TUNEL检测试剂盒用于检测凋亡的细胞。处理过后，细胞用PBS进行清洗，加入4%paraformaldehyde/PBS，然后用含0.2%Triton X-100的 柠檬酸盐缓冲剂通透细胞。样品用TdT和被dUTP标记的荧光剂培养，用DAPI复色，在荧光显微镜(Leica TCS SPE)下观察。通过在随机区域内计数300个细胞来估计凋亡细胞百分比。

1. 免疫萤光染色法

在4˚C环境下，NRK-52E 细胞用4% 多聚甲醛溶液固定30分钟，加入0.2%Triton X‑100培养10分钟。用含10%的山羊血清 10%Triton X-100 0.5%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下培养细胞30分钟来封闭细胞的非特异性抗体结合位点。然后用小鼠单克隆抗体Beclin 1和LC3(1:400 in PBS; Cell Signaling Technology, Inc.)进行孵育，过夜。然后用TRITC和fitc-共轭山羊抗小鼠IgG （1:100 in PBS)在室温下孵育0.5 h。将Heochst 33342加入细胞15分钟。用PBS清洗三次后，在荧光显微镜下观察细胞。

1. 蛋白质印迹分析

NRK-52E细胞在蛋白提取试剂中裂解，离心后提取裂解液。每一次试验中每一份样品中有等量的蛋白，每份蛋白用SDS-PAGE分离，并通过电泳印迹法转移到聚偏氟乙烯膜上。接着蛋白结合膜被封闭，用TBS-Tween-20冲洗。用一抗孵育膜过夜，目前的研究有用到的一抗有：anti-GAPDH, anti-bax, anti-AIF, anti-caspase-3 , anti-p-AKT(Santa Cruz Biotechnology, Inc.),Anti-Beclin 1 和 anti-LC3(Cell Signaling Technology, Inc.)。用TBS-0.1% Tween-20冲洗过，接着在4˚C下用辣根过氧化物酶标记二抗孵育膜过夜。然后用加强的化学发光系统显示印迹。为了比较蛋白不同的水平，每一种信号的密度可用图像分析软件(CS Analyzer; ATTO, Tokyo, Japan)进行评价。

1. 统计学处理

采用单因素方差分析方法对多组间均值差异进行统计学比较，显著性差异假设P值lt;0.05。

1. 结果

AGEs抑制NRK-52E的细胞活性。被AGEs处理过的NRK-52E细胞的细胞活性可以通过MTT法来评估。如图1所示，当细胞被0-2000ug/mlAGEs处理24、48、72小时后，随着浓度ACEs显著抑制NRK-52E细胞的细胞活性。同样的，当细胞被300,700,1000ug/mlAGEs处理0-22小时后，随着时间AGEs抑制NRK-52E细胞的细胞活性（图1B）。姜黄素抑制AGEs诱导的细胞自噬。姜黄素作为姜黄香料最有效的成分，最近被认为具有抑制自噬的作用。本研究旨在探讨在NRK-52E细胞中姜黄素对AGEs诱导细胞凋亡和潜在机制，然后我们进一步假设姜黄素也可以在AGEs的作用下对自噬调控发挥作用。正如图2所示，对被700ug/mlAGEs处理过的NRK-52E细胞添加或者不添加10uM姜黄素培养48h。首先，通过TUNEL分析测定AGEs诱导细胞死亡。正如图2A所示，虽然单独用AGEs处理会导致的细胞凋亡的显著升高，但是联合姜黄素作用可导致AGEs诱导NRK-52E细胞凋亡的减少。我们接下来使用双染细胞凋亡检测试剂盒处理结合流式细胞法结合来间接评价凋亡率评价姜黄素的抗凋亡效应。姜黄素的添加后减少了AGEs诱导凋亡细胞率，从46.2%减少到了28.2%（图2B）。为了更加证实姜黄素的抗凋亡效应，我们开展了western-blot法，AGEs的致损和Bax和AIF的上调有联系，两者蛋白的上调会导致caspase级联反应发生（caspase-3），但是NRK-52E细胞与姜黄素的共育显著减少了AGEs诱导凋亡相关蛋白（图2C-E）。这些结果说明姜黄素对AGEs诱导凋亡具有细胞保护作用。

姜黄素增强了NRK-52E细胞的自噬。凋亡和自噬是在外界压力下维持平衡的两个演变性存在过程。凋亡和自噬两者的交互作用是复杂的，就如自噬在许多细胞条件下可以起促进细胞生存的作用。在本文中，我们探索了姜黄素起细胞保护作用下自噬的作用所在。就如上所说，对被700ug/mlAGEs处理过的NRK-52E细胞添加或者不添加10uM姜黄素培养48h。在姜黄素和AGEs的共同处理下，从荧光显微镜下看到的结果显示，LC-3和Beclin-1的荧光点显著增多（图3A和B），暗示着和单独AGEs处理组相比较，添加姜黄素导致自噬空泡出现。但是，单独用姜黄素处理不会导致NRK-52E细胞自噬增加（图3A和B）。Western-blot也可观察到相似的改变。AGEs 姜黄素组和AGEs组相比，Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著增加（Plt;0.01）（图3C和D）。这些结果显示姜黄素促进NRK-52E细胞自噬。

姜黄素通过保护性自噬抑制凋亡。为了调查姜黄素的抗凋亡效应机制是否为软骨细胞自噬的诱导因素。3-MA是具有很强自噬的抑制剂之一，被用于抑制自噬。如图4所描述的，用2mM3-MA预处理NRK-52E细胞来封锁自噬未发现明显的细胞毒性。从图4A的结果中，姜黄素明显抑制AEGs诱导的凋亡。

图一：AGEs降低了NRK-52E的细胞活性。（A）细胞被0-2000ug/mlAGEs处理24,48,72小时。用MTT法检测细胞活性。（B）细胞被300,700,1000ug/mlAGEs处理0-72小时。用MTT法检测细胞活性。

图二;在AGEs诱导的细胞凋亡中姜黄素的效应。（A）对被700ug/mlAGEs处理过的NRK-52E细胞添加或者不添加10uM姜黄素培养48h。用TUNEL分析法检测细胞凋亡。（B）细胞处理同上，细胞自噬用流式细胞法检测，接着用双染细胞凋亡检测试剂盒处理。每一个变量用平均值plusmn;方差（n=6）来表示.（C-E）细胞处理同上。用western-blot法检测bax，AIF，caspase-3蛋白。用密度测定法评估相应的蛋白水平，并以相对强度表示。GAPDH作为内参照。每一个变量用平均值plusmn;方差（n=6）来表示.(^**Plt;0.01vs.对照组；^# Plt;0.01vs.AGEs组)。

图三。姜黄素促进NRK-52E细胞的自噬。（A）对被700ug/mlAGEs处理过的NRK-52E细胞添加或者不添加10uM姜黄素培养48h。Beclin-1蛋白被着色，然后在荧光显微镜下观察，如材料和方法所示。（B）细胞处理同上，LC-3蛋白着色后在荧光显微镜下观察，如材料和方法所示。（C和D）细胞处理同上，用western-blot法检测LC3和Beclin-1蛋白的表达。结果是三种独立试验的代表。GAPDH作为内参照（**Plt;0.01vs.对照组）。

图四：姜黄素保护性效应中自噬的作用。（A）细胞分别用700ug/mlAGEs，10uM姜黄素，2mM3-MA各处理48小时，或者联合700ug/mlAGEs 10uM姜黄素 2mM3-MA处理48小时。凋亡用细胞自噬用流式细胞法检测，接用双染细胞凋亡检测试剂盒处理。（B和C）细胞处理同上，用western-blot法检测Bax和Beclin-1的表达。结果为三独立试验的代表。GAPDH作为内参照（(**Plt;0.01vs。对照组；# Plt;0.05vs。AGEs组；▲Pgt;0.05vs.AGEs组）

图五.自噬信号通路PI3K/AKT的作用。（A）细胞分别用700ug/mlAGEs，10uM姜黄素，10mMLY294002各处理48小时，或者联合700ug/mlAGEs 10uM姜黄素 10mML

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