钙介导的Cd2 诱导毒性缓解和改善通过巴氏芽孢杆菌的Cd2 的生物矿化外文翻译资料

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钙介导的Cd² 诱导毒性缓解和改善通过巴氏芽孢杆菌的Cd² 的生物矿化

摘 要

微生物诱导碳酸盐沉淀已广泛应用于重金属镉离子的生物矿化。然而，尿毒菌对镉的耐受性较低，限制了其应用，只有较低的镉离子浓度才行。在本研究中，我们发现了一种简单的方法，可以通过立即补充钙离子显著增强尿解菌对镉离子的抗性。钙离子通过使细胞外和细胞内镉离子浓度降低约50%来保护细胞。结果表明，在添加钙离子的条件下，镉离子的去除率可显著提高约100% (52.72% ~ 99.43%，Cd = 5 mM)。此外，极高浓度的镉离子在24 h内几乎被完全去除(C₀ = 20 mM时为99.46%，C₀ = 50 mM时为99.60%)。微观结构分析表明，矿化析出物为菱形CdCO₃，CaCO₃和(Ca0.67, Cd0.33)CO₃。此外，钙离子还能保护溶尿细菌免受其他重金属的毒害。

关键词 微生物诱导碳酸盐沉淀；镉；生物矿化；重金属；钙

1 引言

一般来说，它们在环境中会持续存在，由于它们的毒性，导致世界各地的环境问题日益紧迫，随着工业化和城市化进程的加快，重金属已成为严重的在食物链上不能降解并且不断积累的普遍性污染物。(El-Rafei等人，1987;Mostert等人，2010)。国际癌症研究机构指出，镉(Cd)是一种人类致癌物(IARC, 1993)，通常以Cd² 的形式存在于环境中，与其他重金属相比，对几乎所有生物都有严重的负面影响。(Facchinelli 等, 2001; Walid, 2012;Zhai 等.2015)。它可以通过食物链进入人体，对大脑、肾脏、骨骼、肺、肝脏和生殖系统造成损害(Anetor, 2012; Rinaldi等, 2017)。因此，人们在探索重金属(即Cd² )去除和稳定的修复技术方面做出了许多努力，包括传统的物理和化学方法，这些方法有时不经济或容易产生二次污染(Fu and Wang, 2011; Wiangkham and Prapagdee, 2018; Yasmeen等., 2019)。

近年来，微生物诱导碳酸盐沉淀物(MICP)过程对重金属的生物矿化被认为是一种新兴的有效的重金属污染生物修复方法，引起了环境科学家和工程师的广泛关注(Eltarahony等., 2020; Jalilvand等, 2020; Jiang 等, 2019; Qian等,2017; Zhao 等, 2017; Zhu等, 2016)。利用MICP方法，尿毒菌(即巴氏孢子菌)产生脲酶，在pH升高的情况下将尿素水解为铵离子和碳酸盐离子(Kumari等人，2016;Phillips等人，2013)。产生的碳酸盐离子与重金属离子反应，形成稳定的碳酸盐晶体，导致重金属稳定(Krajewska, 2018)。此外，尿素水解也提高了pH值，这可能会直接促进金属氢氧化物沉淀(即Cu(OH)₂)去除重金属(Krajewska, 2018;Liu等人，2020;Qiao等人，2021)。

通过MICP方法固定化镉离子已经在过去的几年里进行了研究(Bhattacharya等人，2018;Ghorbanzadeh等人，2020年;Khadim等人，2019年;彭等人，2020年;Yin 等人，2020年;赵等人,2019年;赵等人，2017年)。然而，由于镉离子对测试细菌的高毒性，大多数研究都是在低浓度下进行的。据报道，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens, NCIM2919)、阴肠杆菌(Enterobacter cloacae, EMB19,MTCC

10649)、肿大地杆菌剧臭杆菌和冻土毛霉在镉离子浓度超过最低抑制浓度(MIC)0.09‐2 mM时(通常小于MIC)会迅速失活(Bhattacharya等人， 2018年;Hoque和Fritscher, 2019年;Li等人，2016年;赵等人，2017年)因此，其潜在的应用在镉污染严重的地方，如富镉矿渣、河流沉积物和冶炼厂附近的土壤(高达441‐1750 mg/kg)， MICP限制了镉的生物矿化作用(Benin等人,1999年; Buchauer, 1973年; Tyszka等人, 2018年; Wang等人, 2020年)。因此，有一种方法适用于各种情况是至关重要的。所以，我们需要制定一种策略来提高溶尿细菌对镉离子的耐受性，这样MICP驱动的方法可以在不同镉离子浓度下高效地实现镉离子的生物矿化。

几个可能的机制与增强细菌对镉离子的耐药性有关，包括1)减少镉离子的摄取和增强镉离子流出细胞(Mikhaylina等人，2018年;夏等人,2021年)；2)生物沉淀与镉离子结合。 例如，某些细菌可能产生硫化物、磷酸盐、胞外聚合物底物(EPS)，碳酸盐等，以固定镉离子；3)降低镉离子引起的氧化应激。例如，内生细菌沙雷氏菌和肠杆菌可通过其抗氧化潜能缓解镉离子应激反应(Ullah等人，2019年)。在植物、藻类和细胞中，钙离子对镉离子的保护作用已经有了一些报道，这些报道表明，镉离子可以被电压或受体作用的钙离子通道吸收。钙离子通道阻滞剂对钙离子通道的抑制(例如，尼莫地平、硝苯地平、维拉帕米和尼群地平)可以减少镉离子的摄取，有时保护细胞免受镉离子毒性(Blazka and Shaikh, 1991;Hinkle等人，1987年;马,2013;Souza等人，1997年)镉离子是钙离子的类似物，镉离子的吸收受钙离子通道可用性的影响，因此，过量钙离子的存在可能会与镉离子竞争表面结合和运输到细胞，从而降低镉离子的毒性。因此，这些前期的工作启发我们开发一种简单的策略，利用过量的钙离子 (MICP过程中最常见的共价离子，用于各种土木工程应用)来改善以MICP为基础的重金属修复系统。

在这项研究中，钙离子对巴氏杆菌耐药性的影响，这是最广泛应用于MICP的尿毒症细菌，因为其高效的脲酶活性产生和对高浓度钙离子的高耐性(Achal等人2009年;Gorospe等人，2013年;Mugwar和Harbottle, 2016年)进行了研究。此外，我们还通过测量钙离子补充和不补充钙的细菌的生存能力和脲酶活性来研究其可能的机制。进一步研究了镉离子去除效率的提高，并用x射线衍射仪分析了生物矿化的镉离子沉淀(XRD)、能谱仪(EDS)和扫描电子显微镜(SEM)。最后，研究和讨论了钙介导的缓解其他类型重金属对巴氏杆菌毒性的普遍作用。

2 材料和方法

2.1 尿素分解细菌和化学药品的使用

本研究采用巴氏孢囊菌(Sporosarcina pasteurii，中国通用微生物培养收集中心(CGMCC) 1.3687)，一种产生脲酶的非致病性脲解菌。在无菌的需氧间歇酵母提取物(YE)生长培养基(每升含有20 g YE, 15 g NH₄Cl, 1 mM NiCl₂, pH 9.2-9.3)中，28°C培养48小时(Cheng等人，2020年)。在培养生长的固定阶段(OD₆₀₀为3.5，脲酶活性约为18 U/mL)收集培养物，离心(6000 rpm, 15分钟)，收集，洗涤两次，在0.9% wt% NaCl溶液中悬浮。除非另有说明，本研究中使用的细菌细胞溶液的最终OD₆₀₀值和脲酶活性分别为1.2和4-5 U/mL。本研究采用CdCl₂、CaCl₂、尿素、CuCl₂·2H₂O、ZnCl₂·7H₂O、MnCl₂·4H₂O和NiCl₂·6H₂O等化学试剂，通过适当的稀释，得到各实验所需的浓度。

2.2 巴氏杆菌生长试验

为了确定细菌在Cd和Ca存在下的特异性生存状态，将50 mu;L的巴氏杆菌细胞溶液接种于镉离子(5 mM)胁迫下15 min(含Ca² 和不含Ca² )，进行生长测定(5 mM和50 mM)补充(记为Cd@细胞, 5 mM Ca-Cd@细胞，50mMCa-Cd@细胞)，在含有生长培养基的琼脂平板上孵育48小时。使用原始材料进行对照测试也进行了巴斯德氏杆菌细胞溶液的种子培养(标记为“细胞”)。

相同的巴氏杆菌细胞溶液(细胞, Cd@细胞, 5 mM Ca-Cd@细胞和50 mM Ca-Cd@细胞)用LIVE/DEAD BacLight细菌生存能力试剂盒L7012 (Molecular Probes, Inc.)染色，荧光分光光度计(F-320天津，中国广东)和生物荧光显微镜(Mshot MF 31 Guangzhou Mingmei，中国)(Asadishad等人，2011年)。简单地说，就是活/死的原则Baclight染色是用荧光染色剂与细胞核酸结合，使细胞核酸在蓝光激发下发出荧光。在510 ~ 540和620 ~ 650波长处的峰值区域分别代表活菌和死菌。以活菌百分比(0 ~ 100%)为标准，制备一系列样品进行定量校正。(Fang等，2019年)。

2.3 美国巴氏杆菌细胞内和细胞外镉浓度的测量

探讨钙离子对镉的生物吸附和积累的影响巴氏杆菌胞内和胞外Cd² 的分布总在不同的条件下(Cd@细胞和5 mMCa-Cd@细胞)，按照之前的工作进行(Banerjee等人2015;李等人，2020年)。细菌细胞吸收的镉离子总量是通过初始的镉离子减去水相中的浓度得到的。采用乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2 Na)洗涤法获得胞外镉离子的(Cextra)量，多次洗涤，直到EDTA洗涤液中检测不到镉离子为止。此外，细胞内镉离子 (Cintra)的数量是通过超声破坏细菌细胞，然后再测量镉离子。详细的过程可以在支持信息中找到。

为了直观地了解钙离子对巴氏杆菌细胞外镉离子浓度的影响，利用透射电子显微镜(FEI Tecnai G2 F30 S-Twin，美国)结合能量色散x射线(EDX)光谱分析了单个细菌细胞表面的元素能谱。

2.4 巴氏杆菌脲酶活性测定

为了研究钙离子对镉诱导的尿素酶活性抑制的影响，采用在细菌细胞液中加入所需浓度的镉离子和钙离子，进行巴氏杆菌尿素酶活性测定。同时添加尿素，使尿素最终浓度达到1 M，测定反应24 h后尿素水解产生的铵浓度，计算脲酶活性。

2.5 巴氏杆菌MICP工艺去除Cd² 的研究

为了检测钙离子对巴氏杆菌MICP过程中镉去除的影响，我们在不同浓度的Cd² 和Ca² 存在下进行了镉去除实验。为了提供多余的碳酸盐离子沉淀所有的镉离子，除添加20 mM尿素的低浓度镉离子 (0.1-2 mM)外，Cd去除试验中选择的尿素浓度为Cd² 浓度的10倍。反应24 h后，所有样品先以8000 rpm离心15 min，收集上清，0.22 mu;m滤纸过滤，然后测量镉离子浓度。去除效率计算公式为:

R(%)=C_初始-C_残余/C_初始

其中R(%)为去除率，Cini为Cd² 初始浓度(mM)， Cend为Cd² 残留浓度(mM)

2.6 分析方法及表征分析

脲酶活性检测通过测定脲酶活性测定前后产生的铵态氮浓度进行。铵态氮的浓度是用nesler法测定的(Greenburg等人，1992年)。在本研究中，使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)(日本岛津ICPE 9820)检测镉离子的浓度。

收集或不添加钙离子的巴氏杆菌诱导的MICP过程(反应24小时)驱动的镉沉淀通过使用XRD (BRUKER D8 ADVANCE，德国)，SEM, EDS (FEI NovaNano450，美国)。用XRD测定矿化产物的组成。利用扫描电镜(SEM)和能谱仪(EDS)分析了沉淀样品的表面形貌特征和钙和镉的原子分布。

3 结果与讨论

3.1 Ca² 保护巴氏杆菌免受镉威胁

在YE生长培养基琼脂平板上分别用添加和不添加钙的镉离子 (5 mM)进行生长抑制实验。Cd@细胞在培养48小时后几乎没有生长，表明5 mM镉离子条件下细胞完全失活。当5和50 mM 钙离子分别添加(1.3plusmn;0.3times;105和3.6plusmn;0.4times;10^7 CFU/mL）为5 mM Ca-Cd@cell和50 mM Ca-Cd@cell时，生长抑制明显减轻，(图1)。

一致地荧光显微镜观察证实，当钙离子与镉离子补充时，“活细胞”(绿色细胞，细胞膜完整)的数量更多。此外，随着钙离子浓度的增加，观察到更多的“活细胞”(图1B)。这一发现与生长试验的结果一致。此外，利用荧光光谱(两次重复试验)对巴氏杆菌的生存能力进行了研究，结果表明，添加过量的钙离子离子

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