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工程酿酒酵母中类似Crabtree/Warburg效应的需氧木糖发酵

摘要：有效地将木糖转化为具有成本效益的生物燃料方面的瓶颈限制了植物木质纤维素作为可再生原料的广泛使用。酿酒酵母将葡萄糖发酵成乙醇，具有很高的代谢通量，以有氧方式发酵高浓度的葡萄糖，这种特性称为Crabtree/Warburg效应。与葡萄糖相比，大多数工程酿酒酵母菌株发酵木糖时并不以可行的经济速率和产量，它们需要通过呼吸作用来获得足够的木糖代谢通量和有氧生长的能量。在本次研究中，我们构建了呼吸缺陷的酿酒酵母菌株，该菌株可以在有氧条件下生长并使木糖发酵成乙醇，这一特性类似于Crabtree/Warburg效应对葡萄糖的影响。通过基因组序列比较和定向工程，我们确定染色体片段的重复是因为带有工程木糖代谢酶编码基因，以及编码戊糖磷酸途径中转酮酶的基因TKL1，这些基因使得进化菌株获得特异表型。对上述这些酶的重新工程化复制再加上HOG1，ISU1，GRE3 和 IRA2基因的缺失突变，提高了木糖好氧和厌氧发酵的速率。重要的是，我们发现这些遗传修饰在另一个遗传背景下起作用，提高了工业上柳枝稷水解液中木糖转化为乙醇的速率和产量，表明这些特异遗传修饰可以使酵母可持续地生产工业生物燃料。我们提出了一个模型，说明关键调控突变如何通过降低溢出代谢阈值使酵母在有氧条件下发酵木糖，允许突变增加木糖通量并重新定向到发酵产物。

关键词：Crabtree/Warburg效应；代谢工程学；生物燃料；木糖发酵；实验室适应进化；酿酒酵母

1 引言

在过去的几十年中，从柳枝稷等非食用植物中提取的木质纤维素生物质已经被开发为生产可取代石油基燃料的可再生生物燃料的潜在可持续原料（Narayanaswamy等人，2011；Sun和Jin，2021；Williams等人，2019）。大多数木质纤维素原料需要热化学预处理和酶水解才能将植物细胞壁中的纤维素和半纤维素分解为葡萄糖和木糖，这两种糖分别是主要的己糖和戊糖（Pauly and Keegstra，2008）。然而，生物乙醇工业使用的主要发酵微生物——原始酿酒酵母不消耗或发酵木糖，导致纤维素生物燃料生产效率低下，其成本不能与化石燃料竞争（Cunha等人，2019；Kim等人，2013）。

为了克服阻碍以木质纤维素为基础的生物燃料商业化的经济问题，酿酒酵母的基因工程和实验室适应进化（ALE）已被广泛用于提高木糖发酵生成乙醇、异丁醇、乳酸和其他有用生物产品的速度（Brat和Boles，2013；Reyes等人，2014；Sandberg等人，2019；Turner等人，2015）。通过引入来自其他真菌或细菌的木糖代谢酶，已经实现了酿酒酵母对木糖的利用。木糖还原酶和木糖醇脱氢酶（XR-XDH）（Jin等人，2000；Johansson等人，2001）或木糖异构酶（XI）（Brat等人，2009；Kuyper等人，2005）将木糖转化为木酮糖。两种途径都需要木酮糖激酶（XK）将木酮糖磷酸化为木酮糖-5-磷酸，然后通过磷酸戊糖途径和糖酵解途径转化为乙醇（Hahn-Hagerdal等人，2007）。将这些途径单独插入到酿酒酵母中后，酿酒酵母将木质纤维素水解物中的木糖转化为乙醇的速率和产量远不能达到工业所需的速率和产量，因此许多人探索其他的遗传改良。因为我们在本文描述的研究将集中在XI途径上，所以关于通过XR-XDH途径提高木糖消耗的基因发现，我们建议读者参考更全面的综述（Kwak和Jin，2017；Sun和Jin，2021）。

对于XI途径，一些研究小组结合合理的工程设计和实验室适应进化来揭示增加木糖消耗和转化为乙醇的基因修饰。通过合理的工程设计和实验室适应进化，对GRE3（Lee等人，2012，2014；Sato等人，2016；Traff等人，2001）——XI途径的抑制基因（Yamanaka，1969）、编码一种能够将木糖转化为木糖醇的醛糖还原酶的基因，PHO13（Bamba等人，2016；Lee等人，2014）和HXT7（Reider Apel等人，2016）进行突变增加了木糖的消耗量。通过靶向或进化将多个XI拷贝整合到基因组中，以此过表达XI也可以增加木糖的消耗（Dos Santos等人，2016；Jeong等人，2020）。最后，实验室适应进化菌株的基因组测序确定了HOG1、ISU1和IRA2基因功能丧失突变之间的协同作用，这些突变增强了酿酒酵母对木糖的消耗（Dos Santos等人，2016；Sato等人，2016）。这些基因变化影响了各种代谢途径，包括木糖分解代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解和呼吸；这些代谢途径的改变都增强了有氧和无氧条件下木糖的消耗（Sato等人，2016）。

尽管使用多种遗传策略，工程酿酒酵母菌株的木糖发酵的速率和产量尚未达到其利用天然葡萄糖发酵时的速率和产量。葡萄糖的摄取和分解代谢的通量如此高，以至于即使在有氧的情况下，酿酒酵母也可以在高浓度下发酵葡萄糖，尽管与有氧呼吸相比，此时ATP产量较低。这种现象被称为Crabtree/Warburg效应（Crabtree，1929；Warburg等人，1927），该效应出现在酿酒酵母中可能是通过复杂的调控机制的进化，如通过葡萄糖抑制下调呼吸作用中的基因，以及全基因组重复（Conant和Wolfe，2006；Lin和Li，2011；Pfeiffer和Morley，2014；Thompson等人，2013）。一些研究者认为葡萄糖有氧发酵代谢是由于丙酮酸从呼吸作用溢出到生产乙醇的发酵过程中，从而使酿酒酵母在自然环境中与对乙醇敏感的微生物相比具有竞争优势（Kotter和Ciriacy，1993；Pronk等人，1996）。

与葡萄糖相反，一些研究已经确定，用于木糖代谢的酿酒酵母菌株主要在有氧条件下发酵木糖。例如，在有氧条件下，我们发现一个在ISU1中发生突变的工程木糖发酵菌株在木糖上生长时上调了参与线粒体呼吸的蛋白质（Sato等人，2016）。此外，用抗霉素A（一种氧化磷酸化抑制剂）处理这种菌株，可以阻断需氧生长和木糖的消耗。另一些研究报道，木糖发酵代谢的酿酒酵母菌株将木糖视为不可发酵的碳源，导致在木糖上有氧培养时，与TCA循环、乙醛酸途径、呼吸代谢和葡萄糖异生有关的基因上调（Jin等人，2004；Osiro等人，2018；Runquist等人，2009；Salusjarvi等人，2008；Scalcinati等人，2012）。这些结果表明，有氧条件下工程菌株中的木糖通量可能不足以导致丙酮酸溢出到乙醇中，这是自然条件下酿酒酵母利用葡萄糖时的效应即Crabtree/Warburg效应。

在此次研究中，我们试图确定遗传变化，使酿酒酵母能够以高通量发酵木糖产生乙醇，这样它就能在有氧时发酵木糖而无需通过呼吸作用，这是葡萄糖Crabtree/Warburg效应的标志。我们首先通过敲除COX15来阻断木糖消耗型酿酒酵母的呼吸作用，COX15编码的线粒体内膜蛋白参与了细胞色素C氧化酶必需的修饰基团血红素A的合成（Barros 等人，2001；Glerum等人，1997）。然后将这种呼吸缺陷突变株用木糖作为主要碳源，进行有氧实验室适应进化。对进化的克隆进行基因组测序，以确定特定的遗传变化。通过将进化菌株中发现的两个遗传变化的菌株重组为原始亲本菌株，我们得到了一个在没有呼吸作用情况下木糖有氧发酵增加的菌株。重要的是，这种重组工程菌株在实验室培养基和木质纤维素水解物中在厌氧时以更快的速率将木糖发酵成乙醇。最后，在另一个菌株存在时，这些基因变化增加了木糖的转化率，这表明基因修饰的组合可以整合到现有的工业酿酒酵母菌株中。

2 材料和方法

2.1 培养基

如前人所述制备标准的实验室酵母培养基（Sherman，2002）。简单来说，该酵母培养基中含有10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨（YP）和不同浓度的碳源（X = 20-30 g/L木糖，D = 20 g/L葡萄糖，Gal = 20 g/L半乳糖，Gly = 20 g/L甘油，EtOH = 15 g/L乙醇）。固体培养基中还含有2.5%琼脂和200 mu;g/mL的遗传霉素（US Biological，Swampscott，MA），200 mu;g/mL的潮霉素B（US Biological，Swampscott，MA），100 mu;g/mL的诺尔丝菌素（Jena Bioscience，Jena，Germany）或200 mu;g/mL的博莱霉素（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）。按照他人研究所述制备AFEX-预处理的柳枝稷水解物（ASGH）（Zhang等人，2020）。

2.2 构建酿酒酵母工程菌株

表1和S1记录了本次研究使用的酵母菌株。将LoxP-KanMX-LoxP（pUG6）或LoxP-HphMX-LoxP（pUG75）质粒模板产生的聚合酶链式反应（PCR）产物（Guldener等人，1996）和含有40-60 bp同源序列的引物（Parreiras等人，2014）整合在一起，检测COX15、TAL1、xylA、XYL3、TKL1、GRE3、IRA2、HOG1和ISU1基因的缺失。将PCR产物纯化并转化进入适当的菌株（Gietz和Schiestl，2007）。在其他地方切除Cre重组酶介导的LoxP-flanked抗生素标记（Guldener等人，1996）。用修饰的pRS416质粒（Christianson等人，1992）对cox15△突变进行互补，用HphMX标记（pRSCENHygMX）URA3营养缺陷型，并含有COX15启动子、开放阅读框（ORF）和终止子。如前所述（Higgins等人，2018），通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术并进行一些修改，完成了TAL1-xylA-XYL3表达盒（XYL盒）和TKL1启动子、终止子和ORF的额外拷贝的插入。首先，用一个KanMX抗生素标记替代了目的菌株中的GRE3 ORF（gre3△: : LoxP-KanMX），或通过同源重组插入到ChrI（ChrI199269）的199，269和199，270之间。ChrI199269是假基因的位点，它曾被用作转基因插入的位置（Hittinger和Carroll，2007）。然后将pXIPHOS质粒（Higgins等人，2018）转化进入选定的菌株以表达Cas9和sgRNA序列（ATGAAGGAGAAAACTCACCG），该质粒由CRISpy-pop设计（Stoneman等人，2020）以作用于KanMX。在20倍摩尔过量下共转化含有GRE3的50-60 bp侧翼序列的XYL盒和含有ChrI位点的TKL1 PCR产物，以作为修复模板。将转化后的菌落重新在YPD上培养两次，恢复培养pXIPHOS质粒，然后PCR和Sanger测序验证TAL1-xylA-XYL3和TKL1是否插入。所有菌株均采用独立的外引物PCR进行基因缺失和抗生素标记切除。威斯康星大学麦迪逊分校生物技术中心对PCR产物和DNA质粒进行Sanger测序。表1和S1中列出的所有菌株都可以根据与威斯康星校友研究基金会的材料转移协议获得。

2.3 实验室适应进化（ALE）

通过实验室适应进化，获得利用缺乏COX15的GLBRCY583（Y583）菌株进行无呼吸作用时有氧发酵木糖的克隆筛选。将Y583接种在3个分别含有3%木糖和0.05%葡萄糖的30 mL YP培养基的烧瓶中，在600 nm波长（OD₆₀₀）下光密度为0.2，并在250 rpm和30^oC下摇匀。当每个烧瓶的细胞密度达到OD₆₀₀=2-6时，将培养物用新鲜培养基传代至OD₆₀₀=0.2。第二代培养基含有0.1%葡萄糖，之后的传代培养基都缺乏葡萄糖。按照高效液相色谱（HPLC）和折射率检测（RID）的方法，每次培养6-8代，直到48小时内达到最大细胞密度，并且从培养基中消耗所有木糖（Schwalbach等人，2012）。将在仅含有木糖的培养基上表现显著生长的三种ALE培养物中的两种涂布到YPX 潮霉素B琼脂平板上。在下面描述的烧瓶实验中，测试来自两个进化的烧瓶的分离的菌落在木糖上有氧生长。使用1 cm宽的比色皿和Beckman Coulter DU720分光光度计测量OD₆₀₀。从两个单独进化的细胞生长和木糖消耗率最快的烧瓶中选择单克隆（Evo1和Evo2）进行进一步研究。

2.4 基因组DNA文库的制备和序列分析

按照之前的方法（Sato等人，2016）进行基因组DNA制备和Illumina测序，并在此基础上做了一些修改。将DNA提交给威斯康星大学麦迪逊分校生物技术中心。使用Qubitreg; dsDNA HS检测试剂盒（Life Technologies，Grand Island，NY）验证DNA浓度。根据微小修改的TruSeq Nano DNA LT文库Prep试剂盒（Illumina inc.，San Diego，California，USA）制备样品。使用Covaris M220 超声仪（Covaris Inc，Woburn，MA，USA）剪切样本，并使用基于SPRI颗粒的尺寸排除法，选择平均插入大小为550 bp的样品。分别使用Agilent DNA1000芯片和Qubitreg; dsDNA HS检测试剂盒评估成品文库的质量和数量。文库标准化为2 nM。

使用Illumina PE Cluster kit和Illumina cBot执行簇生成。使用在Illumina HiSeq 2500测序仪上的v4 SBS化学试剂对配对末端进行125-bp测序。使用Illumina Pipeline 1.8.2版分析图像。所有DNA测序读数已经存储在BioProject P

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