从胡萝卜小杆菌克隆的一种新的腈基还原酶的生化性质外文翻译资料

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从胡萝卜小杆菌克隆的一种新的腈基还原酶的生化性质

摘要：腈类还原酶是一类新发现的能催化腈类化合物直接还原成胺的酶类，是有机合成化学中非常重要的反应。然而，自从首次发现腈基还原酶，十多年来，这一生物催化反应在有机合成中的应用进展甚微。潜在的原因之一可能是结构信息和生化性质的缺乏，此外还有其固有的狭窄底物范围。同时，由于腈基还原酶活性位点的高度保守性，使得利用蛋白质工程方法拓宽其底物谱成为一大挑战。为了探索更多具有不同特性(如比活力、热稳定性等)的腈基还原酶用于潜在的合成应用，从胡萝卜小杆菌基因组中发现了一种新的腈基还原酶，命名为PcNRed，相对于其天然底物preQ0具有366U/g蛋白的中等比活力。将PcNRed在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，纯化至均一，并对其生化特性进行检测。最佳反应温度为40℃，最适pH为7.4。PcNRed的热失活过程符合一级动力学，在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为47.2h、13.6h和3.9h。测定了两种底物NADPH和PreQ0的动力学常数，得到催化常数Kcat分别为0.025/s和0.024/s，米氏常数Km值分别为0.229 mM和lt;0.25mu;M。为了揭示PcNRed的结构信息，建立了同源模型，并与相应的酶进行了比较，为这一新型酶的进一步工程设计奠定了基础。

关键词：生物催化 腈还原酶 基因组数据挖掘 生物化学特性 腈

1.导论

腈类化合物是合成各种药物、农用化学品、精细化学品以及散装化学品的重要构件。腈类化学的传统生物催化方法主要由四类酶组成，包括腈水解酶、腈水合酶、固氮酶和加氧酶[1]。其中，腈水解酶和腈水合酶已被成功地用作生物催化剂，分别用于从其腈类前体工业化生产羧酸和酰胺[2，3]。除了这四种腈类转化酶外，羟腈裂解酶是另一类参与腈类转化的重要生物催化剂，特别是在手性氰醇的合成过程中，这一点也得到了商业规模的运作[4]。最近，人们发现了一个与腈代谢有关的新的酶家族，它可以催化腈基团直接还原为伯胺，特别是在转移核糖核酸(tRNA)(方案1)的生物合成过程中，2-氨基-5-氰基吡咯[2，3-d]嘧啶-4-酮(PreQ0)在NADPH作用下被还原为相应的胺，2-氨基-5-氨基吡咯[2，3d]嘧啶-4-酮(PreQ1)。传统的化学方法总是需要苛刻的反应条件，如高压、高温和危险化学品，而腈基还原酶介导的把腈基还原为伯胺,具有环境友好性以及高选择性的优点，将为开发环境可持续的腈基还原生物催化剂以取代金属氢化物催化剂铺平道路[9-12]。而且，对映体选择性差，化学还原成本高，经济效益低。以上提到的内容都体现了人们对这类新兴酶的极大兴趣。

不幸的是，自从发现这一新的酶家族已经过去十多年了，但除了对其晶体结构和反应机理的阐明外，这一独特的酶在有机合成中的应用进展甚微。其中一个重要的原因是腈基还原酶的底物范围很窄，活性位点残基高度保守，这给通过蛋白质工程扩展其底物谱带来了很大的挑战。因此，具有不同特性(如比活性、热稳定性等)的新的腈基还原酶的发现将为进一步的工程设计以获得工业上适用的生物催化剂提供广泛的起点。本文报道了从胡萝卜状细小杆菌中获得的一种新的腈还原酶(PcNred)的分子克隆、高效表达和生化特性。系统地研究了PcNRed的生化性质，构建了同源模型，并与相应的模型进行了比较，以期对PcNRed的结构有一定的了解。

方案1.腈还原酶催化的7-氰基-7-去氮鸟嘌呤(PreQ0)还原为7-氨甲基-7-去氮鸟嘌呤(PreQ1)。

2.材料与方法

2.1化合物和菌株

1. 氨基-5-氰基吡咯[2，3-d]嘧啶-4-酮(PreQ0)由韶远化学科技有限公司(中国上海)提供。NADPH(钠盐；gt;95%纯度)购自阿拉丁(中国上海)。其他所有化学品都是商业途径获得，不需要进一步提纯就可以使用。

用于基因组挖掘的微生物菌株来自德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)和中国通用微生物培养保藏中心(CGMCC)。用大肠杆菌DH5alpha;和大肠杆菌BL21(DE3)克隆和表达了腈还原酶。

2.2PcNred基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用上海天根TIANamp细菌DNA试剂盒从胡萝卜腐杆菌中提取基因组DNA。根据PcNRed基因序列设计带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的寡核苷酸引物(GenBank登录号：CP003776.1)。扩增PcNRed基因片段，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入表达载体pET-28a(Novagen，上海)。将得到的质粒pET-28a-PcNRed转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。细胞在37℃含50g/ml卡那霉素的LB培养基中培养。当培养液OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-d-1硫代半乳糖苷，在16℃继续培养24h。

2.3PcNred的提纯

离心收集细胞，用生理盐水洗涤两次，再悬浮在缓冲液A(20 mM磷酸钠，pH 7.4,500 mM NaCl，10 mM咪唑)中，用超声振荡器(JY92-Ⅱ，新芝生物科技有限公司)破碎。在4℃下离心(9300g，60min)除去细胞碎片，然后将上清液装入His Trap Ni-NTA FF柱(1ml，GE Healthcare Corp.)。用缓冲液A预平衡，缓冲液A以1ml/min的流速洗脱，咪唑梯度从20 mm增加到500 mm。用SDS-PAGE分析纯化产物的纯度。将含有目的蛋白的组分与20 mM磷酸二氢钠缓冲液(pH7.4)混合透析脱盐。最后，将酶样品浓缩保存在含20%甘油中，温度minus;80℃，以备进一步使用。

2.4酶测定法

用分光光度法在30℃下测定PcNRed的活性，记录NADPH在340nm处的吸光度在规定的时间内(通常为300s)的下降值。该反应体系由0.1M Tris-HCl(pH7.4)、0.1 mM NADPH、0.1 mM preQ0和适量酶组成，总体积为1ml，在标准测定条件下，每分钟催化氧化1mu;mol NADPH的酶量定义为1单位酶活。

2.5PH和温度的最佳值与热稳定性

PcNred的最适pH为：柠檬酸钠(pH4.0minus;6.0)、磷酸钠(pH6.0minus;7.5)、Tris-HCl(7.5-9.0)、Na2CO3-NaHCO3(9.0-10.0)。在20℃到70℃的标准测定条件下确定了最适温度，通过测定PcNRed在所需温度(30、40和50℃)下培养一定时间后PreQ0的残存活力来检测PcNRed的热稳定性。所有检测均为一式三份。

2.6金属离子和EDTA对PcNred活性的影响

在30℃下，分别加入终浓度为10M和100M的化合物，考察了不同金属离子和乙二胺四乙酸对PcNRed活性的影响，并在标准测定条件下测定了PcNRed的酶活性。对照实验是在没有任何测试化合物的情况下进行的。所有检测均为一式三份。

2.7动力学常数的测量

通过测定不同底物(PreQ0)浓度(0.2~20M)、固定NADPH浓度(0.2mM)下纯化的PcNRed酶活，测定了PcNRed的动力学常数。同样，为了测定NADPH的动力学常数，在0.1mM的preQ0存在下，NADPH的浓度在4~100M之间变化。根据Lineweaver-Burk图计算了纯化酶的表观Km和Kcat值。

2.8底物范围

为了探索PcNRed在有机合成中的潜在适用性，方案2中列出的一系列腈类化合物被用于酶活性测定，如preQ0所述。反应混合液为0.1M Tris-HCl(pH 7.4)，底物0.1mM，0.2mM NADPH和适量的纯化酶。以PreQ0为底物，将活性归一化为还原酶活性。在对照实验中，测量的反应速率也被修正为空白读数，说明了NADPH轻微的非特异性氧化。

方案2.用于剖析腈还原酶PcNred底物光谱的腈化合物。

2.9建模和对接

使用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi))提供的BLAST作为工具的蛋白质序列比较表明，PcNred与霍乱弧菌的腈还原酶(VcNRed)具有中等序列同源性(约62%)，其晶体结构可在蛋白质数据库(PDBID：3uxv.1.A)[13]中找到。以VcNred的晶体结构为模板，用瑞士模型在线工具(http://swissmodel.expasy.org)[14])构建了PcNred的同源结构，并用PROCHECK进行了验证。使用Autodock Vina进行分子对接以获得PcNred与底物preQ0[15]之间的相互作用。所有的图像都是由软件PyMOL[16]创建的。

3.结果与讨论

3.1腈还原酶的筛选

采用基因组数据挖掘的方法，寻找能够将2-氨基-5-氰基吡咯[2，3d]嘧啶-4-酮(PreQ0)还原为相应的胺，2-氨基-5-氨基吡咯[2，3d]嘧啶-4-酮(PreQ1)的潜在酶。从NCBI数据库中选择了28个腈基还原酶候选，其氨基酸序列与已知的编码腈基还原酶的序列具有30-80%的同源性，并在大肠杆菌中过表达(表1)。在还原preQ0到preQ1的反应中，胡萝卜杆菌腈基还原酶的活性相对较高，因此被选为潜在的生物催化剂进行进一步的研究。BLAST搜索显示，PcNRed与霍乱弧菌腈还原酶(VcNRed)有62%的氨基酸序列同源性。根据它们的氨基酸序列，腈还原酶被认为属于隧道折叠(T-折叠)超家族，这是一个与平面蝶呤/嘌呤底物结合的功能距离较远的蛋白质的结构超家族[17]。T-折叠超家族可分为两个结构亚家族，一个是以枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)和嗜酸地芽孢杆菌(Gebacillus Kaustophilus)的两种腈还原酶为代表的单峰亚家族，另一个是以大肠杆菌酶(EcNRed)和霍乱弧菌酶为代表的双峰亚家族。序列比对表明，PcNRed是一个由大约280个氨基酸组成的蛋白质，由两个保守结构域组成，一个是N-端序列，属于COG2904超家族成员，功能未知；另一个是C-端序列，包含催化残基[13]，与EcNRed和VcNRed相似。乍一看，枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)和考斯特嗜酸地质杆菌(Gebacillus Kaustophilus)的腈基还原酶与PcNRed的T-折叠区的氨基酸序列有很高的同源性。与EcNRed和VcNRed相似，PcNred含有两个串联的T-折叠结构域，其中腈还原酶基序(E(S/L)K(S/A)HK(L/Y)(Y/F/W)，其中h是疏水氨基酸，保守的Cys和Glu残基在空间上是分开的，分别位于弱同源的N-末端和C-末端T-折叠结构域[18]。