单一突变增加了胡萝卜杆菌腈还原酶的活性和稳定性外文翻译资料

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单一突变增加了胡萝卜杆菌腈还原酶的活性和稳定性

摘要:腈还原酶被认为是一种有前途的环境友好的腈还原生物催化剂，可以取代传统的金属催化剂。不幸的是，迄今为止报道的腈还原酶的催化效率非常低。迄今为止，蛋白质工程增加腈还原酶催化活性的任何尝试都失败了。在这项工作中，我们成功地增加了通过改造底物结合口袋，胡萝卜杆菌腈还原酶的比活性从354 U gprot–1提高到526 U gprot–1，同时热稳定性也有所提高(约2倍)，半衰期在30°C下为140小时和40℃下为32小时。在2-氨基-5-氰基吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-酮(preQ0)到2-氨基-5-氨基甲基吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-酮(preQ1)的生物还原中，变体是优于野生型酶，具有更高的反应速率和在更短的时间内完全转化底物。同源性建模和对接分析揭示了活性和稳定性增加的一些可能来源。这些结果为进一步提高腈还原酶的催化效率奠定了坚实的基础，这是将这种新型生物催化剂应用于合成化学的先决条件。

介绍

腈是一组非常重要的中间体，用于合成各种药物、农用化学品、精细化学品和散装化学品。与传统化学还原方法的苛刻反应条件相比，腈的生物催化转化因其固有的生态友好反应条件、突出的选择性(立体选择性、化学选择性和区域选择性)以及较少的副产物而具有优势。因此，腈转化酶包括腈水解酶、腈水合酶、羟基腈裂解酶和醛肟脱水酶，引起了学术界和工业界的极大关注。最近，出现了一类新的腈转化酶，即腈还原酶，作为腈生物转化的有用的生物催化剂，其中腈可以通过以下方式直接还原成伯胺消耗两摩尔辅助因子NADPH。pre Q0还原为preQ1涉及转移RNA (tRNA)中发生的高修饰核苷的生物合成，其中将产生的preQ1修饰成鸟苷衍生物鸟苷，鸟苷被认为在增加翻译的保真度中起重要作用。腈还原酶的发现被认为为腈化学中新的催化应用铺平了道路。

方案一 腈还原酶催化的PreQ0到PreQ1的生物还原PcNRed。

到目前为止，大多数研究集中于从不同微生物中克隆和表征新的腈还原酶，解析晶体结构，以及阐明腈还原酶的反应机制和底物结合模式。以前的研究也表明腈还原酶的催化效率相当低因此，腈还原酶在有机合成中应用的先决条件是通过蛋白质工程来提高其催化活性和/或热稳定性，这已被证明是为工业应用目的定制酶的有力工具。然而，到目前为止，只有两篇关于腈还原酶的蛋白质工程的报道，尽管这类酶已经发现了十多年。在这两项研究中，进行了结合氨基酸残基的底物的合理设计，旨在提高其催化活性。不幸的是，与野生型酶相比，这两项研究都导致了显著较低的催化活性。高度保守的底物结合口袋进化性差，使得腈还原酶作为实用生物催化剂的开发面临巨大挑战。

为了应对这一挑战，我们试图从胡萝卜杆菌中克隆出一种新的腈还原酶(PcNRed ),其野生型在迄今为止报道的腈还原酶中表现出最高的活性。

结果和讨论

PcNRed的定向进化，以提高对preQ0的活性

为了指导蛋白质工程过程，基于来自霍乱弧菌的腈还原酶的晶体结构(PDB ID: 3uxv.1. A，62%同一性)建立了PcNRed的同源模型，然后将天然底物preQ0对接在该结构的活性位点上。在最开始，催化残基Cys190周围的氨基酸残基在6内进行饱和诱变(图s1)。不幸的是，我们没有得到任何比野生型酶活性更高的突变体。显示活性高于30%的野生型酶被纯化并测量了它们的比活性(表2)。同样，除了PcNRed H224N表现出比天然酶活性高1.5倍之外，大多数变体表现出比野生型酶低的活性。

表1。Ala扫描基底周围6A内的残留物。 表二。热点残基的饱和诱变。

酶 比活性(U g–1蛋白质) 酶 比活性(U g–1蛋白质)

野生型 354plusmn;0 野生型 354plusmn;0

D23A N.D. N38E 158plusmn;8

L37A 32plusmn;1 N38G 132plusmn;3

N38A 68plusmn;1 N98G 156plusmn;9

L95A N.D. S99G 297plusmn;5

N98A 54plusmn;1 H224T 192plusmn;8

S99A 134plusmn;3 H224V 82plusmn;7

F100A N.D. H224N 526plusmn;3

N101A N.D.

[a]通过记录NADPH在340 nm下5分钟内的吸光度下降，在30C下用分光光度法测定活性。的反应混合物由总体积为1 m的Tris-HC1 (100 mM， pH 7.4)、0.1 mM NADPH、 0.1 mMpreQ0和适量的酶组成。

Q102A N.D.

H224A 152plusmn;2

E230A N.D.

Q231A N.D.

C232A N.D.

1. 通过记录NADPH在340 nm下5分钟内的吸光度下降，在30℃下用分光光度法

测定活性。反应混合物由总体积为1 mL的Tris-HCl (100 mM，pH 7.4)、0.1 mM

NADPH、0.1 mM preQ0和适量的酶组成。[b]未检测到。

因为Cys190周围的残基仅占活性口袋的一部分，所以衬在底物结合口袋上的残基被作为目标，这些残基总是被认为对酶活性非常重要。然后，我们在除了催化三联体(Cys190、Asp 197和His 229)之外的6rsquo;内底物周围的氨基酸残基中进行丙氨酸扫描，并对第一步中选择的位点进行饱和诱变，旨在将筛选工作保持在最低水平，并快速找出进一步工程的热点(图s 2)。如表1所示，总共获得了5个活性突变体，但活性比野生型酶低得多，而其他8个突变体都导致酶活性完全丧失，表明这8个残基是不可替代的。这一结果也进一步证实了高度保守的底物结合残基的不良进化性。[12]基于5个热点残基(Leu37、Asn38、Asn98、Ser99和His224)和变体进行饱和诱变。

为了进一步提高腈还原酶活性，我们还基于PcNRed的整个DNA序列的易错PCR进行了几轮随机诱变。然而，在筛选约5000个菌落后，没有获得比PcNRed H224N活性更高的突变体。然而，我们通过改造腈还原酶的活性位点口袋，首次将PcNRed的活性提高了1.5倍。

动力学常数

研究了纯化的PcNRed和PcNRed H224N对preQ0和NADPH的动力学常数(表3)。根据比活性结果，测定了preQ0和NADPH的稳态动力学常数，表明PcNRed H224N的催化效率高于PcNRed。在以preQ0为底物的情况下，用Asn取代His224导致KM值从4.3 M下降到2.5 M，kcat从0.12s–1至0.16s–1，从而导致kcat/KM增加2.3倍。而对于共底物NADPH，KM值从17 M降低到12 M，kcat从0.2s–1增加到0.33s–1导致kcat/KM增加了2.35倍。

表1。PcNRed和PcNRed H224N的动力学参数。

[a]在固定的NADPH浓度(0.2 mM)下，preQ0的浓度从0.001 mM变化到0.2 mM。[b]存在0.1 mM preQ0时，NADPH浓度在0.004–4mM范围内变化。该分析在45℃和pH 7.5下在1 mL的反应体积中进行。

图一。温度对PcNRed(方形)和PcNRed H224N(菱形)活性的影响。相对活性表示为标准分析条件下最大活性的百分比。

图二。pH对PcNRed(开放的)和PcNRed H224N(填充的)活性的影响。在以下缓冲液中测量活性:金刚石、磷酸钠缓冲液(pH 5.0-8.0)；三角形，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0–10.0)。相对活性表示为标准分析条件下最大活性的百分比。

变体的酶特性

PcNRed和PcNRed H224N的温度和pH依赖性是通过在20°C至70°C的温度范围内(图1)和pH值在pH 5至pH 10范围内(图2)测量酶活性来确定的。PcNRed和PcNRed H224N均在40°C显示最佳反应温度，然而，PcNRed H224N在升高1的温度(例如60°C amp; 70°C)下显示出比野生型酶显著更高的活性，这表明该变体比野生型酶更耐热。PcNRed和PcNRed H224N的pH依赖性之间没有显著差异。

还在30℃和40℃下检测了PcNRed和PcNRed H224N的热稳定性，以进一步证实变体的热稳定性提高(图3)。该变体在30℃和40℃下分别显示140小时和32小时的半衰期，这明显好于天然酶的半衰期(60小时和13小时)，表明该变体比野生型更稳定。T 15是在热处理15分钟后失去50%初始酶活性的温度，这允许直接比较具有不同热稳定性的酶。因此，对其进行了测量，以获得关于变体热稳定性改善的更多信息(图S3)。与最适温度和热稳定性的结果非常一致，该变体显示出47℃的T 15，比野生型酶(45℃)高2℃。所有这些结果表明该变体比野生型酶更稳定。

图3。PcNRed(开路)和PcNRed H224N(填充)在30°C(菱形)和40°C(三角形)时的热失活。残余活性表示为0小时时测量的初始活性的百分比

为了获得关于PcNRed H224N增加的活性和热稳定性的结构见解，进行了同源性建模和对接分析，比较了野生型酶和变体之间的差异(图4)。在PcNRed的情况下，His224与来自另一个亚单位的Gln102形成氢键，这可能部分阻断位于两个亚单位之间的底物通道(图4A)。至于PcNRed H224N，Asn224与相邻Arg223的主链氧而不是Gln102形成氢键，氢键将Asn224的侧链拖离Gln102以及底物通道，从而为底物通道提供更多空间，并允许底物或辅因子自由转运通过底物通道(图4B)。这也通过变体比野生型酶更高的kcat和更低的KM得到证实(表3)。Asn224除了与Arg223的主链氧形成氢键外，还分别与Phe222的主链氧和Arg223的主链氮形成氢键。虽然在野生型酶中也观察到了两个氢键，但应该注意的是，在PcNRed H224N中形成的所有三个氢键都位于alpha;-螺旋4和alpha;-螺旋5之间的同一环中，形成活性位点袋。预计该环中的氢键网络会增加环和活性位点袋的刚性，从而增强酶的稳定性。这也符合变体比野生型酶更好的热稳定性(图3 amp;图S3)。

图4。PcNRed (A)和PcNRed H224N (B)的同源性建模和对接分析。催化三联体(Cys190、Asp197和His229)为绿色，位于alpha;-螺旋4号和5号之间的氨基酸残基为青色，另一个亚基中的残基Gln102为品红色，辅因子NADPH为橙色，天然底物preQ0为灰色。

preQ0至preQ1与PcNRed和PcNRed H224N

为了评价工程酶的催化性能，将PcNRed和PcNRed H224N用于preQ0到preQ1的生物转化。如图5所示，PcNRed H224N的反应速率明显快于野生型酶，产物的分析产率在6小时内达到100%。然而，在PcNRed的情况下，即使在延长反应时间(8小时)后，产物的分析产率也仅为85%，这表明工程酶的更高催化效率确实可以加速反应。改进的腈还原酶在preQ0至preQ1的生物还原中的更好性能表明，对于实际应用，变体腈还原酶需要更少的生物催化剂负载或更短的反应时间来达到与野生型酶相似的结果，这对于工业过程非常有吸引力，因为更少的生物催化剂负载将降低生物催化剂的成本，而更短的反应时间将提高过程效率。

图5。通过PcNRed(空心正方形)和PcNRed H224N(实心正方

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