黄芪内生真菌的抗菌活性

Peiji Liu · Dekui Zhang· Ruirui Shi· Zhengyou Yang · Fengchun Zhao· Yuan Tian

摘要：目的是研究黄芪内生真菌的抗菌活性。分离到3种具有抑菌活性的内生真菌，根据相邻系统进化树鉴定为Chetomium sp. HQ-1、Fusarium sp. HQ-7和Fusarium sp. HQ-9。Chetomium sp. HQ-1具有最好的抗菌潜力，因此被选择进行大规模发酵。对菌株HQ-1的代谢酵母菌进行生物活性定向分离，从HR-ESI-MS和NMR数据分析中发现了3个化合物，分别为异苯甲醚A(1)、2,6-二氯-4-丙基酚(2)和4,5-二甲基间苯二酚(3)。这三种化合物均对单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌表现出中度抗菌活性，MIC值为16-128mu;g/mL。化合物1和3对Selerotium rolfsii具有较好的抑菌活性，IC₅₀值分别小于16和32mu;g/mL，与8mu;g/mL放线菌酮相当。本研究结果表明，该植物内生真菌具有作为杀菌剂和杀真菌剂的潜力。

关键词：真菌; 黄芪; 毛壳属; 抗生素; 异苯甲醚A

引言

耐药细菌的不断出现，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌等，表明耐药传播速度加快，成为严重的全球公共卫生问题。据报道，每年约有70万人死于耐抗生素细菌，如果不努力解决这个问题，这个数字还会继续增加。然而，近几十年来，FDA批准的抗菌药物种类不断减少。氟喹诺酮，一种40年前发现的抗生素，是最新上市的抗革兰氏阴性菌药物。由于新疾病的出现和严重的细菌耐药性，对新型抗生素的需求日益增加。

一般来说，发现新的药物分子有三条途径:合理药物设计、化学合成和天然产物发现。由于独特的结构、低成本和强大的生物活性，天然产物药物的发现重新赢得了化学家、生物学家和药理学家的兴趣。来自植物的天然产物已被证明是最有前景的一种。然而，植物组织中许多生物活性化合物的含量并不充足。为了解决这个问题，人们发现并利用了内生植物。

内生菌是一种微生物(主要是细菌和真菌)，在其生命周期的某一时期居住在植物中，可能产生与植物宿主类似的生物活性化合物。此外，为了适应生物体特殊的内部环境，它们通常具有独特的生理和代谢机制，增加了产生新的活性物质的可能性。近年来，内生植物已成为人们关注的热点，并被证明是一种未被充分开发的天然产物资源。

黄芪(Astragalus)是一种结构多样、生物活性丰富的中草药。黄芪内生菌的一些生物活性代谢物也已被报道。然而，对于中国黄芪内生菌，其抗菌潜力从未被研究过。结果表明，三种内生真菌均能产生具有抗菌潜力的生物活性物质。其中一株Chaetomium sp. HQ-1含有3种具有抗菌活性的化合物。研究结果为开发利用内生真菌作为抗菌活性的生物来源提供了科学依据。

材料和方法

内生真菌的分离与鉴定

中华黄芪(Astragalus chinensis)是在山东省泰安市采集的。根据之前详细介绍的方法进行了一些修改，从健康的中国拟南芥组织中分离得到真菌。用蒸馏水充分清洗组织，并按如下方法消毒。组织样品先后浸泡在75%乙醇2分钟,5%的次氯酸盐3分钟,75%乙醇2分钟,最后用无菌蒸馏水冲洗5分钟。随后,样本切成碎片(1平方厘米的叶子和1厘米茎的长度)并放入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)补充50micro;g/mL氨苄青霉素抑制细菌生长。这些样品在28°C下有氧培养7天。将纯菌落转移到新鲜培养基(PDA)中，在4℃保存以备进一步使用。

根据制造商的建议，用真菌DNA试剂盒(OMEGA)提取真菌基因组DNA。ITS基因扩增和测序由上海BioSune公司完成。在GenBank中对各分离物的ITS基因序列进行BLAST搜索。利用MEGA 7.0和1000个引导复制，获得了密切相关的菌株，以建立邻接距离树。

内生真菌的发酵

将每一分离物的真菌菌丝接种于两个250ml的厄伦美厄烧瓶中，一个含有100ml的马铃薯葡萄糖(PD)肉汤，另一个含有100ml的麦芽提取物(ME)液体培养基，在28°C的旋转摇床(150 rpm)上培养10天。将培养的发酵液用两层薄纱布过滤，再用0.22micro;m细菌过滤器过滤，无菌发酵液在4℃保存以进一步进行生物活性检测。

真菌发酵液的抗菌活性

对3种革兰阳性菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、MRSA(本地分离株)和单核增生李斯特菌(CGMCC1.10753)，以及2种革兰阴性菌大肠杆菌(本地分离株)和肠炎沙门氏菌亚种的抑菌活性进行了筛选。用琼脂井扩散法测定enterica血清(ATCC10708)。将细菌涂在Luria-Bertani (LB)琼脂平板上(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl, 1.5%琼脂)。然后在平板上钻孔，以氨苄西林(50 mu;g/mL)为阳性对照，新鲜LB培养基为阴性对照，倒入发酵液100micro;L。37℃孵育24 h后，测定抑菌圈直径。每次抗菌活性试验设3个重复。筛选出生物活性最好的菌株，利用性能较好的培养基(ME)进行高档发酵。

抗菌化合物的提取、纯化和表征

高档发酵是在一个1000毫升的锥形瓶含有400毫升的ME肉汤。将10 L的发酵液在28°C, 150 rpm的摇床上培养10天，用乙酸乙酯过滤提取。用旋转蒸发除去溶剂，得到5.2 g粗提物。

粗提物经硅胶( 200-300目)柱层析，石油醚/丙酮混合极性增大(100:1,50:1,25:1,10:1,5:1,v/v)洗脱，得到五个馏分(F1-F5)。用琼脂孔扩散法(如上所述)检测洗脱部位的抗菌活性。通过Sephadex LH-20和半制备反相高效液相色谱分离纯化抑制细菌生长的部分，分别得到化合物1 (51 mg)、2 (9 mg)和3 (12 mg)。

生物活性化合物的结构通过安捷伦G6230 TOF质谱仪和核磁共振(NMR)光谱仪(Bruker Avance600, Germany)鉴定。以四甲基硅烷(TMS)为内标，测定了丙酮-d₆的¹H NMR和¹³C NMR谱。

最低抑菌浓度的测定

最低抑菌浓度(MIC)的测定方法参照Sharma等人的方法，并做了一些修改。首先，制备化合物或氨苄西林的原液(256 mu;g/mL在LB肉汤中)。然后，在无菌5 mL管中用LB肉汤(1 mL/管)用2倍连续稀释法稀释。随后，在每个试管中加入等量的过夜培养菌。8个管的最终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2和1 mu;g/mL。LB肉汤作为阴性对照。所有试管均在200 rpm的旋转摇床上37℃孵育24小时。以最低抑菌浓度(MIC)作为抑制供试微生物生长的最低浓度。

化合物的抗真菌活性

本实验室分离鉴定了4种植物病原菌:罗氏芽孢杆菌(Selerotium rolfsii)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、层次镰刀菌(Fusarium stratum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。试验如前所述，进行了少量修改。用两倍连续稀释法产生不同浓度的化合物，并在培养皿(直径9厘米)中与预热过的PDA完全混合。化合物的终浓度范围为128-1mu;g/mL。放线菌酮作为阳性对照。将试验真菌的菌丝转移到固化培养基中心，28℃培养6天。按(1minus;Da/Db)times;100计算抑制率，其中Da为实验板上的菌落直径(mm)，Db为对照板上的菌落直径(mm)。

结论

内生真菌的鉴定

从中国拟南芥中分离到3个形态类型不同的真菌(1个来自叶片，2个来自茎部)(图1)。对其ITS基因进行了扩增和测序(GenBank登录号为MK597925-MK597927)。ITS基因序列的系统发育分析表明，中国拟南芥内生真菌未形成单一系群。从邻近连接树(图2)可以看出，菌株HQ-1与chetomium rectangulare IRAN1641C的亲缘关系最近(99.44%)，因此，菌株HQ-1为毛壳属。同样，分离株HQ-7和HQ-9也被鉴定为镰刀菌属的成员。

图1 从黄芪中分离的真菌内生菌。中国黄芪植物图片;真菌内生菌HQ-1、HQ-7和HQ-9的b-d图像;e分离内生真菌的相应植物组织;f-h真菌内生菌在ME和PD培养基上发酵

图2 3株真菌分离株ITS序列的邻居连接系统发育树。内生菌株以粗体突出显示。分支点上的数字是基于1000次重采样的引导值。在分支点上显示35%以上的引导值。标尺表示每个位置改变0.020个核苷酸。

用琼脂扩散法测定发酵液的抗菌活性

用琼脂扩散法对3种真菌的ME和PD发酵液进行了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的分离鉴定。从表1可以看出，ME发酵液比PD发酵液具有更强的抗菌活性。结果表明，Chaetomium sp. HQ-1对金黄色葡萄球菌、MRSA、单核增生球菌、大肠杆菌和S. enterica subsp. enterica serovar的抑菌活性最高，分别为17 mm、18 mm、16 mm、15 mm和11 mm。因此，我们选择chetomium sp. HQ-1进行进一步研究。

表1 不同内生真菌ME和PD发酵液的抑菌活性

–：没有抑制作用

生物活性化合物的结构表征

化合物1是一种非晶态白色粉末，通过高分辨率电喷雾质谱(HR-ESI-MS)分析，Na 配体分子离子在m/z 301.0034 (calcd for C11H12Cl2O4Na, 301.0036)测定其分子式为C₁₁H₁₂Cl₂O₄。¹ H NMR(600MHz; acetone-d₆; delta;, ppm; J, Hz): 3.91 (3H,s),3.09(2H,t,J=8.4),1.63(2H,dt,J=7.8,8.4),1.00(3H,t,J=7.8).¹³CNMR (150MHz;acetone-d₆;delta;,ppm):171.9,157.8,157.1,142.8,121.5,115.8,113.3,60.9,34.7,23.8,14.5. 这些数据与异苯甲醚A的数据相同(图3)。

化合物2是一种非晶态白色粉末，其分子分子式为C₉H₁₀Cl₂O，其质子化分子离子在m/z 205.0802 (C₉H₁₁Cl₂O需要205.0799)。¹H NMR (600 MHz; acetone-d₆;delta;,ppm;J,Hz):8.01(1H,s),6.17(2H,s), 2.41(2H,t,J = 8.4),1.56 (2H,dt,J=7.8,8.4),0.90(3H,t,J=7.8). ¹³C NMR(图S6)(150MHz; acetone-d₆; delta;,ppm):159.3,145.6,107.7,107.6,100.9,100.8,38.7,25.1,14.1. 这些数据与2,6-二氯- 4-丙基酚的数据相同（图3）。

化合物3作为非晶态白色粉末被分离出来，在其HR-ESI-MS谱图中，Na 配体分子离子的m/z为161.0716，表明其分子式为C₈H₁₀O₂ (C₈H₁₀O₂Na需要161.0712)¹HNMR(600MHz;acetone-d₆;delta;,ppm; J, Hz):7.96(1H,s), 7.82(1H,s), 6.24(1H,s),6.18(1H,s),2.12(3H,s),2.00(3H,s).¹³CNMR(150MHz;acetone-d₆;delta;,ppm):156.5,156.2,138.9, 114.1,108.2,100.7,20.3,11.0. 这些数据与4,5-二甲基间苯二酚的数据相同（图3）。

图3化合物结构1-3

生物活性化合物的MIC

用试管稀释法测定了三种化合物对3种革兰氏阳性菌和2种革兰氏阴性菌的MIC值。如表2所示，化合物1对单核增生球菌的MIC为16 mu;g/mL，对金黄色葡萄球菌和MRSA的MIC为128 mu;g/mL。与异苯甲醚A相比，抗生素氨苄西林对单核增生球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较高(MIC为2mu;g/mL)，对耐药病原菌MRSA的抑菌活性较低(MICgt;128mu;g/mL)。化合物2和3对单核增生球菌的抑制作用最强，MIC值分别为64和32mu;g/mL。

表2三种化合物与氨苄西林的MIC值

生物活性化合物的抗真菌活性

以4种植物病原真菌为研究对象，以

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