果实表观遗传组学以及CRISPR/Cas9 介导的CNR和NOR基因敲除突变体揭示果实成熟调控网络存在多样性和冗余性外文翻译资料

果实表观遗传组学以及CRISPR/Cas9 介导的CNR和NOR基因敲除突变体揭示果实成熟调控网络存在多样性和冗余性

Ying Gao¹, Ning Zhu², Xiaofang Zhu¹, Meng Wu¹, Jiang Cai-Zhong ^3,4, Donald Grierson⁵, Yunbo Luo¹, Wei Shen²,Silin Zhong², Da-Qi Fu¹ and Guiqin Qu¹

摘要

番茄被认为是成熟期果实的遗传模型，包括乙烯、成熟转录因子和DNA甲基化在内的三个主要因素控制果实的成熟过程。果实表观组学研究表明，在不同的物种中，有多个转录调节网络调节果实的成熟进程，而且H3K27me3，而非DNA甲基化，在调控这些成熟途径中起关键作用。此外，番茄成熟核心转录因子的功能现在受到质疑。我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除番茄果实成熟模型中的主要调节因子SBP-CNR和NAC-NOR的表达，发现突变体植株果实只表现出部分不成熟或延迟成熟的表型，与已知的原始突变体Cnr和nor不同，后者完全不能成熟，这表明它们可能是功能获得型突变体。除了全基因组的DNA甲基化水平增加外，这些原始突变体内果实成熟相关的基因如ACS2、RIN和TDR4中H3K27me3保持较高的水平。因此，我们推测很可能存在多种遗传和表观遗传因素共同作用导致了这些突变体果实的不成熟表型。因此，我们建议该领域应超越这些线性和二维模型，并接受这样一个事实，即重要的生物过程如成熟通常由来自多个层面的、高度冗余的信号网络来调控。

对于开花植物来说，果实作为种子的传播媒介，通常是由心皮或邻近的花组织进化而来的。果实成熟通常被描述为一种改变了种子器官的生理和生化特性，从而有助于种子的扩散的发育过程^（1）。这使得植物能够与共同进化的动物相互作用，这些动物消耗果实并将排泄的种子散布到远处，从而提高植物的繁殖成功率^（2）。Charles Darwin也承认它的进化优势，因为“美丽只是鸟类和野兽的向导，以便果实可以被吞食，成熟的种子可以传播”。

然而，在分子水平上，将一个普通的心皮转化成美味的果实并不是一项简单的任务。这需要对心皮基因表达网络进行完全的重新编程，在此期间，成百上千个基因必须以高度协调的方式被打开和关闭。正是这些所谓的“成熟基因”在精确发育时期的联合作用改变了心皮组织的几乎每一个方面，如颜色、香味、风味、质地和营养含量等，以吸引以果实为食的动物作为种子分散者。这一过程也必须受到严格的网络调控，因为种子成熟前的任何过早转化都是有害的。

这一成熟调控网络吸引了科学家数十年，也对世界各地的农业产生了重要影响，因为它影响了我们园艺产品的产量、营养价值和保质期。以番茄为模型阐明其遗传和表观遗传基础的研究取得了重大进展^（3，4）。番茄成熟模型有三个关键组成部分:激素乙烯、成熟转录因子(CNR、NOR和NOR)和DNA甲基化。然而，来自果实表观遗传组学的最近发现表明，这一模型并不通用，因为至少有三种不同类型的转录正反馈回路控制着七种更年期物种的成熟^（5）。只有番茄具有全基因组DNA，CG和CHG去甲基化，以及CHH超甲基化，而大多数物种使用H3K27me3来调控成熟网络。H3k27me3标记成熟基因可以追溯到干燥和非更年期的水果，其中他们调控花器官的特性和衰老。此外，基因沉默和基因编辑技术现在使我们能够重新检查对其生物功能的争议有时甚至是相互矛盾观点的番茄果实成熟转录因子^（6-8）。

在这项研究中，我们从基因组和进化的角度研究了成熟调控网络的多样性。我们还提供了新的证据表明，利用CRISPR/Cas9技术诱导的番茄核心成熟转录因子SBP-CNR和NAC-NOR的突变体未能消除成熟，这表明成熟的转录调控网络是高度健壮的，很少有单点故障。在一个强大的调控网络中，突变表型的缺乏并不一定意味着该基因不参与生物过程，而表型的存在可能表明该过程对于植物进化备用计划来说不够重要。现在是植物生物学家重新评估那些由传统遗传研究产生的线性和二维模型的时候了，这些模型通常是在单一物种研究的基础上开发出来的。毕竟，复杂而重要的生物过程，如成熟，通常由具有来自多个表观基因组水平的输入的、高度冗余的转录网络调控。

番茄成熟模型不是通用的

植物激素乙烯是番茄以及其他更年期果实从营养生长到成熟过程中必不可少的^（9，10）。当应用于成熟的番茄果实时，乙烯可以促进成熟，而缺乏乙烯生物合成或信号传导的突变体则无法开启它们的成熟过程^（11-13）。值得注意的是，乙烯无法在果实未成熟阶段(种子不能存活或在其他非果实组织中)成熟，最重要的是，这表明存在一个在种子成熟之前防止果实过早成熟、协调果实和种子的发育的网络。因此，系统1和2乙烯的假设经常被用来描述乙烯如何控制果实成熟^（14）。在这个模型中，系统1乙烯由基础水平的营养组织产生并且是自抑制的，而系统2乙烯由成熟的果实产生并且是自催化的。

系统1和2转变背后的遗传学还没有被完全理解。然而，来自不成熟突变体的基因克隆表明，番茄果实成熟需要三种转录因子（TFs）:MADS-box成熟抑制因子(RIN)、SBP-box无色不成熟因子(CNR)和NAC转录因子不成熟因子(NOR)^（11-13）。这三个突变体不能合成系统2乙烯，而它们的系统1乙烯生产，如伤害乙烯，仍保持功能。此外，外源乙烯不能恢复这些突变体的成熟，而系统1乙烯反应如叶片衰老和幼苗三重反应基本不受影响。因此，这三种转录因子被认为是番茄果实成熟的主要调控因子。

在这三种成熟的TFs中，RIN是研究最好的.大量的ChIP-Seq实验表明，它可以直接与番茄成熟基因的启动子结合，包括细胞壁软化基因PG、EXP1、CEL2、香气生物合成基因LoxC、色素形成基因PSY1，以及其他TF基因，如NOR、CNR、AP2a、FUL1/2^{（4、5、15）}。最重要的是，RIN还与乙烯生物合成基因ACS2和ACO1的启动子结合^（5，16）。启动子基序分析和ChIP-Seq也证实了乙烯转录因子EIN3与RIN的启动子结合，完成了一个正反馈回路，符合McMurchie等人提出的自催化系统2乙烯，1972^（14）。随着这种MADSloop在成熟的果实中被激活，少量的乙烯可以迅速自我扩增并驱动下游成熟基因的表达(图1)。然而，乙烯是一种应激激素，持续的乙烯合成会扰乱植物的生长，甚至导致组织死亡，如叶片衰老和花脱落^{（10，17）}。因此，抑制非成熟组织中的正反馈循环对植物来说是至关重要的。DNA甲基化被认为是抑制番茄成熟基因的原因^（4）。令我们惊讶的是，我们没有在其他物种的成熟基因启动子中发现保守的DNA甲基化改变^（5），这表明这可能是番茄的一个独特事件。

图1 果实成熟调控模型。 乙烯转录因子EIN3激活MADS或NACTFs，而这些TFs激活乙烯生物合成基因，形成正反馈电路，在成熟过程中产生自催化乙烯。下游成熟基因通过这些TFs直接耦合到环路。在叶片和未成熟果实中，该环被基因体内与DNA高甲基化相关的关键基因抑制或抑制组蛋白标记H3K27me3。

H3K27me3与两种动物的关键发育基因的沉默有关^（18），并被多梳压抑配合物催化结合，该复合物可浓缩染色质并沉默基因表达。在植物中，H3K27me3以沉默开花调节因子开花位点和花同源基因AGAMOUS而闻名，这两个基因都是MADS-box转录因子^（19）。结果表明，H3K27me3在限制更年期果实成熟基因的表达方面起着保守作用，甚至在干果和乙烯非依赖性肉质果实中也是如此(图1)。这表明果实成熟机制起源于祖先被子植物中已存在的途径。此外，像番茄、桃子和香蕉这样的植物不仅从它们的祖先那里借用了基因来构建成熟回路，还借用了它们的表观遗传标记。

重新检查成熟主调节因子cnr、RIN和nor

我们对番茄成熟调控的大部分了解来自于三个未成熟的番茄TF突变体(cnr、rin和nor)。rin突变体是由DNA缺失引起的，导致截短的RIN融合到相邻的MADS基因MACROCALYS上^（12）。曾经有人认为嵌合RIN-MC融合蛋白不可能具有生物学功能，RIN是一种功能丧失的突变体，而最近的证据表明并非如此。野生型番茄中CRISPR/Cas9敲除和RIN的RNAi沉默仅重建了部分非成熟表型，与rin突变体完全不成熟不同^（5，6）。另一方面，在RIN背景下敲除或RNAi沉默嵌合RIN-MC突变蛋白可以部分恢复成熟。这些结果表明rin实际上是增益功能突变体^（8）。

为了检查剩余的CNR和NOR基因，这些基因也被认为是成熟所必需的主调节基因，我们使用CRISPR/Cas9在它们的基因位点中产生了多个潜在的真正敲除突变。我们发现CNR CRISPR系只显示延迟成熟表型，而NOR系显示类似于RIN CRISPR/Cas9突变体的部分不成熟表型。两者都不同于其天然突变体的强非成熟表型(图2和3)。

对其果实的RNA-Seq分析表明，与天然突变体相比，在CRISPR/Cas9系中，成熟标志基因如ACS2、ACO1、PSY、PG和EXP的表达不是完全沉默的(图4a、b和表S1)。在原始nor突变体中，ACS2和RIN基因位点与高H3K27me3标记相关，而在cnr表型突变体中，在成熟转录因子TDR4/FUL1中也发现了高H3K27me3(图4c)，这表明H3K27me3可能在其强非成熟表型中起作用。

最初的cnr表位突变体被认为是由SBP-CNR基因启动子的286 BP区域的超甲基化引起的，从而降低了其基因表达^（13）。全基因组DNA甲基化分析表明，cnr果实经历了全基因组DNA甲基化^（4,5）。DNA甲基化酶SlCMT3的VIGS沉默可以恢复cnr果实的成熟^（20），这表明除了SBP-CNR本身的参与之外，其他基因位点的DNA超甲基化可能有助于其非成熟表型，或者在CNR突变基因位点中存在未知的功能增益特性。

图2 部分非成熟表型的NORCRISPR/Cas9基因敲除。a NORgRNA靶位点的位置(T2231-209bp，T1281-302bp，T4363-341bp，T31169-191bp)。b 第11行CRISPR编辑位点的Sanger测序(删除位于215-218bp的CTCC的四个碱基和位于269bp的A的一个碱基，将位于219-225bp的CACCGG替换为GGTGGGA)和第19(删除位于347-351bp的GAACT)。 红色字母表示gRNA目标位点，绿色字母表示编辑的位点，蓝色字母表示原生质体相邻基序(PAM)。c CRISPR/Cas9果实相比，CRISPR/Cas9果实的部分非成熟表型

后基因组时代如何定义转录因子功能

转录因子（TF）是一种能够进行转录调节的序列特异性DNA结合蛋白。TF最重要的属性之一是序列偏好，确切地说是结合位点。因此，下游靶基因启动子中的顺式调节元件，不仅仅是TF蛋白本身的生化特性，还在很大程度上定义了TF的生物功能。与普通的酶编码基因不同，我们必须从两个层面考虑TF的功能：TF蛋白本身的生化功能和由其靶基因的顺式调节元件决定的调节功能。例如，当一个苹果TF可以拯救一个番茄TF功能缺失突变体时，这并不一定意味着这两个TF具有保守的功能，因为它们可能在它们的天然基因组环境中调节一组完全不同的基因。

这是进一步复杂的事实，TFs也需要其他蛋白质信号如中介和RNA聚合酶II启动转录或招募染色质修饰因子间接激活或抑制转录。因此，辅助因子也影响TF的生化特性，更不用说TF本身可能缺乏效应功能，而是由空间机制作用。最初的NAC NOR和MADS-RIN突变体的情况很可能是这样的，它们保留的假定的DNA结合结构域中突变蛋白要么被截断，要么与其他突变体融合。虽然它们可能缺乏转录激活功能，但它们可以阻止其他TFs与相同的位点结合，导致功能增益非成熟表型。

图3 CNR CRISPR/Cas9基因敲除的表型。a CNR位点(T1535-557bp，T2564-586bp，T3604-582bp，T4712-690bp)四个gRNA靶位点的示意图)。b 第22行CRISPR编辑位点的Sanger测序(删除位于5

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