双特异性蛋白激酶CDPKs的酪氨酸自体磷酸化可以降低激酶活性外文翻译资料

双特异性蛋白激酶CDPKs的酪氨酸自体磷酸化可以降低激酶活性

原文作者：Man-Ho Oh, Xia Wu, Hyoung Seok Kim, Jeffrey F. Harper, Raymond E. Zielinski, Steven D. Clouse, Steven C. Huber

单位：Elsevier B.V.代表欧洲生物化学学会联合会

摘要：尽管钙依赖蛋白激酶(CDPKs或CPKs)被归为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，但大豆CDPKbeta;和几种拟南芥亚型(AtCPK4和AtCPK34)均观察到酪氨酸残基的自磷酸化。我们鉴定了作为His₆-GmCDPKbeta;的自磷酸化位点的Ser-8, Thr-17, Tyr-24(在激酶结构域)，Ser-304和Ser-358。整体自磷酸化增加了合成肽的激酶活性，但根据Y24F定向突变体的研究，Tyr-24的自磷酸化似乎减弱了激酶活性。虽然还有很多工作要做，但很明显，一些CDPKs是双特异性激酶，这增加了磷酸酪氨酸信号可能在Ca² /CDPK介导的过程中发挥作用的可能性。

关键词：钙依赖蛋白激酶；酪氨酸自身磷酸化；定点诱变；钙信号；肽激酶活性

1. 介绍

钙信号转导是调控植物生长发育关键环节的重要第二信使，许多特定的机制参与了钙信号转导[1]。一个重要的机制涉及到钙离子对蛋白质磷酸化的调控，这部分是由钙依赖蛋白激酶家族(CDPKs或CPKs)完成的，该家族存在于陆生植物、绿藻和某些原生生物(纤毛虫和顶复虫类)[2]。CDPKs被分类为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被微摩尔或亚微摩尔浓度的游离Ca² 激活，不需要外源性钙调素。这是因为植物CDPKs有一个钙调蛋白样结构域(CLD)，它包含四个Ca² 结合的EF手。CLD位于激酶结构域的C端，在激酶结构域和CLD之间是一个自抑制连接域，在Ca² 缺失的情况下抑制激酶结构域[3-5]。为了响应Ca² 的增加，Ca² 结合到CLD并导致Ca² -CLD与连接域的相互作用，减轻激酶活性的抑制。

CDPKs的钙激活当然是这个蛋白激酶家族的标志，但调控也可能涉及自磷酸化。然而很明显，通过自磷酸化调控CDPKs并不像某些RD类型激酶那样简单，这些激酶是通过激活段内残基的自磷酸化直接激活的。RD型激酶包含RD(精氨酸-天冬氨酸)二肽序列，位于VIb亚结构域，通常与活性激活环内需要自磷酸化的激酶相关[6]。CDPKs是RD激酶，但在需要自磷酸化的位置有一个酸性残基(在APE基序的N端有9个残基)，从而消除了自磷酸化的需要[7]。然而，大量研究表明CDPKs以Ca² 依赖的方式在丝氨酸和苏氨酸残基上自磷酸化[3,8 - 11]。在迄今为止对重组拟南芥CDPKs[10]进行的最广泛的调查中，在8个CDPK亚型和2个CDPK相关激酶(CRKs)上鉴定出35个丝氨酸和苏氨酸自磷酸化位点。目前尚不完全清楚的是，自磷酸化如何影响激酶活性，尽管平衡的证据表明，自磷酸化促进活性[12,13]。

在这里，我们报道了大豆CDPKbeta;、AtCPK4和AtCPK34对丝氨酸、苏氨酸和(出乎意外的)酪氨酸残基的自磷酸化，这表明至少一些CDPKs是双特异性激酶，而不是目前分类的丝氨酸/苏氨酸激酶。自磷酸化位点包括Tyr-24，它是激酶结构域的第一个残基，在拟南芥CDPKs中严格保守。我们发现，GmCDPKbeta;的整体自磷酸化增加了激酶活性，而用苯丙氨酸取代Tyr-24导致激酶活性增加，这表明酪氨酸自磷酸化抑制活性，而丝氨酸和苏氨酸自磷酸化增强活性。

1. 材料和方法
   1. 重组蛋白的生产和免疫印迹

使用QuikChange XL定点突变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA, USA)对GmCDPKbeta;进行定点突变，其中Tyr-24被苯丙氨酸取代，生成Y24F定向突变体。测序确认突变区后，在BL21(DE3)pLysS细胞(Novagen)中表达His6-GmCDPKbeta; (Y24F)突变体或野生型蛋白。如上所示，在大多数实验中，大肠杆菌细胞培养在添加1 mM CaCl₂或1 mM EGTA的LB培养基中。用Ni² -NTA珠纯化His₆标记的CDPKbeta;蛋白[14]。将重组CDPKs转移到PVDF膜后，使用抗磷酸酪氨酸或抗磷酸苏氨酸抗体，或使用Pro-Q金刚石磷酸蛋白染色(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，通过免疫印迹法分析其自磷酸化。用抗His₆抗体(GenScript, Piscataway, NJ, USA)免疫印迹法检测重组蛋白。用荧光二次抗体(Invitrogen)检测免疫复合物，见[15]。免疫印迹按[16]所述进行，使用奥德赛红外成像系统(Li-COR Bioscience, Lincoln, NE, USA)进行密度测定以定量免疫印迹结果。定点诱变引物为:正向5rsquo; -GCG AGG CTA AGG GAC CAC TTC GTT CTG GGG AAG AAG CTG，反向5rsquo;-CAG CTT CTT CCC CAG AAC GAA GTG GTC CCT TAG CCT CGC。一般来说，所有实验都至少重复两次，并给出有代表性的结果。

• 1. LC–MS/MS分析

用6 M尿素和50 mM碳酸氢铵(pH 7.8)提取大肠杆菌蛋白。蛋白质提取物用胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, USA)消化，用C18 SPE柱(Alltech, Deerfield, IL, USA)收集胰蛋白酶肽。通过Pierce TiO2自旋柱(Thermo-Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)或固定化金属亲和层析(IMAC; PHOS-Select Iron Affinity gel, Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA)。富集的多肽用Pierce石墨自旋柱纯化(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)用于LC-MS /MS分析(见补充数据)。

• 1. 肽激酶检测

在常规的分析中，肽激酶活性是用先前描述的用1mm游离Ca² 测定的合成肽底物来测定的[14,17]。在图4的实验中，从含1 mM EGTA的LB培养基中培养的大肠杆菌细胞中纯化出His₆-GmCDPKbeta;蛋白。纯化的蛋白(1.5 mu;g)在含2 mM EGTA、100 mM KCl、20 mu;M ATP和10 mM MgCl₂的10 mM MOPS-KOH中孵卵，pH 7.0，在不同浓度的CaCl₂中产生95至750 nM的游离[Ca² ]。反应在室温下进行1 h，然后用免疫印迹法分析。从三次测定并至少代表两个独立的实验中得出报告平均值plusmn;S.E.M.。

1. 结果
   1. CDPKs在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上发生自磷酸化

一种常见的实验方案是在大肠杆菌中表达表位标记的重组CDPK，亲和纯化蛋白，在分析磷酸化氨基酸之前，用ATP孵育体外自磷酸化[10,12,18]。然而，蛋白激酶在细菌细胞的生产过程中可以自磷酸化，我们利用这个系统来检测CDPKs的自磷酸化[19]。图1记录了大肠杆菌中IPTG诱导过程中三个CDPKs的自磷酸化随时间的变化。在每个时间点，亲和纯化His₆标记的蛋白，用检测磷酸苏氨酸(抗pThr)或磷酸酪氨酸(抗pY)的磷酸化氨基酸抗体进行免疫印迹分析等量的蛋白。零时刻存在的蛋白反映了由于T7启动子的渗出而表达的CDPK蛋白，并且在苏氨酸残基上有微弱的自磷酸化，而不是酪氨酸残基上。由此可见，三种CDPKs中苏氨酸残基的自磷酸化水平随着诱导时间的增加而增加。然而，令人惊讶的结果是，这三个CDPKs也在酪氨酸残基上发生了自磷酸化(图1)。对于GmCDPKbeta;和AtCPK4，苏氨酸的自磷酸化先于酪氨酸的自磷酸化，而对于AtCPK34，两个残基的自磷酸化都遵循相似的时间过程，但相对于其他测试的异构体而言，明显延迟。最令人惊讶和重要的结果是，CDPKs作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也具有酪氨酸激酶活性，因此是双特异性激酶。在后续研究中，我们主要关注GmCDPKbeta;，试图扩展这一结果。

图1. 重组CDPKs在大肠杆菌中的自磷酸化作用。(A) His6-GmCDPKb、(B) His6-AtCPK4和(C) His6-AtCPK34为蛋白质在0时和其他指定时间添加IPTG诱导，它们表示重组蛋白的亲和纯化和分析自身磷酸化状态，并通过染色ProQ钻石污点或与抗磷酸苏氨酸(抗pthr)或抗磷酸酪氨酸(抗py)抗体交叉反应分析自磷酸化状态。

我们通过LC-MS /MS分析确定了GmCDPKbeta;自磷酸化的特定位点，包括三个丝氨酸残基(Ser-8, Ser-304和Ser-358)，一个苏氨酸残基(thr17)，重要的是，一个酪氨酸残基(Tyr-24)(图2A)。这些残基的位置如图2B所示。GmCDPKbeta;是AtCPK4的同源基因，之前的研究[10]鉴定了Ser- 360(与GmCDPKbeta; Ser-358同源)作为自磷酸化位点。其他位点此前均未发现，特别是酪氨酸自磷酸化位点尚未被报道或发现。Tyr24是GmCDPKbeta;激酶结构域的第一个残基，在拟南芥CPK家族成员中严格保守，表明其他CDPKs也可能在这个位置发生自磷酸化。值得注意的是，Ser-358对应于另几个拟南芥CDPKs的自磷酸化位点[12]。最后同样有趣的是，本研究发现的5个自磷酸化位点中有3个聚集在或接近于N端结构域。这种聚类在之前更广泛的调查研究[10]中已经被注意到，尤其有趣的是，在某些情况下，CDPK的N端可能在底物特异性中发挥作用[20]。

图2. GmCDPKbeta;上自磷酸化位点的鉴定。(A) LC-MS /MS结果总结表明，通过TiO₂或Fe³ - IMAC富集磷酸肽获得GmCDPKbeta;自磷酸化位点。“P-bodies”是指用TiO₂消化富集的不溶性“蛋白体”部分的分析。对于每次浓缩，所获得的谱数都被指出。M:漏裂数；Score：这是一个基于概率的Mowse算法的实现；总得分是观察到的匹配是随机事件的绝对概率，计算为10LOG10(P)，其中P是绝对概率；Expect：期望值，直接相当于Blast搜索结果中的e值。期望值越低，得分越显著。每一种磷酸盐的光谱作为补充图提供。(B) GmCDPKbeta;的示意图，显示了(A)中列出的磷酸基的位置。KD：激酶结构域；J：自抑制结域；CLD：钙调蛋白样结构域，4个EF手(开放椭圆形)。

重组GmCDPKbeta;的酪氨酸磷酸化化学计量学相当高，因为80%的GmCDPKbeta;蛋白可以用固定化抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀(图3)。因此，未能通过[³² p] -磷酸酪氨酸分析检测到磷酸酪氨酸的原因可能是使用的重组蛋白酪氨酸残基上已经被高度自磷酸化大肠杆菌隔绝，或者至少对酪氨酸来说体外自身磷酸化不像原位自身磷酸化那样那么有效。无论如何，这里需要注意的一点是，GmCDPKbeta;的酪氨酸自磷酸化的化学计量相当高，因此可能具有重要的功能。

图3. 重组His6- GmCDPKbeta;的高化学计量学酪氨酸磷酸化。用抗His6抗体直接免疫沉淀GmCDPKbeta;蛋白(lane 1)。第二等分的GmCDPKbeta;蛋白用固定抗pY抗体(2-6泳道)进行5轮顺序免疫沉淀，然后用剩余上清中的抗His6抗体(7泳道)进行免疫沉淀。在每种情况下，用抗磷酸酪氨酸(抗pY)、抗磷酸苏氨酸(抗pT)或抗His6抗体对洗涤后的免疫沉淀进行免疫印迹分析。很明显，抗pY抗体有效地从溶液中去除GmCDPKbeta;蛋白，并且密度测定显示大于80%的GmCDPKbeta;蛋白在酪氨酸残基位上被磷酸化。

• 1. 酪氨酸的自磷酸化在体外是Ca² 依赖的

在我们的GmCDPKbeta;研究中，酪氨酸的自磷酸化在体外很容易监测。在本实验中，重组蛋白在大肠杆菌中酪氨酸自磷酸化水平较低的情况下诱导10 h后纯化(见图1A)。纯化后，在含有所有必要成分和可变浓度的游离Ca² 的反应混合物中，允许蛋白质在室温下自磷酸化1小时。在没有Ca² 的情况下，磷酸化酪氨酸仍然很低，但在低浓度的游离Ca² 存在时，磷酸化酪氨酸增加，在亚微摩尔Ca² 浓度时达到最大效果(图4A)。在这些实验中,独立的CDPK中的一些磷酸苏氨酸与磷酸酪氨酸同步增加(图4A和B)。最重要的结果是, 正如所预期的那样，酪氨酸自身磷酸化确实可以观察到在体外以严格Ca² 端依赖的方式发生。这表明酪氨酸自磷酸化并不是在细菌中过表达的激酶或受到细菌蛋白的某种影响而造成的伪影。

图4. Ca² 依赖的体外酪氨酸自磷酸化

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