通过蛋白质激酶发出钙信号。拟南芥钙依赖蛋白激酶基因家族外文翻译资料

通过蛋白质激酶发出钙信号。拟南芥钙依赖蛋白激酶基因家族

原文作者：Shu-Hua Cheng, Matthew R. Willmann, Huei-Chi Chen, and Jen Sheen

摘要：在植物中，大量的受Ca² 刺激的蛋白激酶的活性通过钙依赖蛋白激酶(CDPKs)激活。这些新颖的钙传感器可能是植物应对各种内部和外部环境变化的关键介质。然而，大多数CDPKs的确切生物学功能仍然是未知的。拟南芥基因组预计编码34种不同的CDPKs。本文分析了拟南芥CDPK基因家族，综述了植物CDPK基因的表达、调控以及可能的功能。通过将新兴的细胞学和基因组学技术与遗传学和生物化学方法相结合，研究拟南芥CDPKs的特性，为理解植物钙信号网络提供了宝贵的理论支持。

关键词：钙依赖蛋白激酶(CDPKs)；

钙是真核生物信号转导过程中普遍存在的第二信使。在植物中，胞内Ca² 水平被调节以响应各种信号，包括激素、光、机械干扰、非生物胁迫和病原体诱导物(Sanders et al., 1999; Evans et al., 2001; Rudd and Franklin-Tong, 2001)。在Ca² 介导的信号转导过程中如何调控反应特异性是一个重要的生物学问题。似乎是不同的刺激诱发了特定的钙信号，这些信号是通过改变血流动力学、大小和细胞来源产生的(Malhoacute; et al., 1998; Allen et al., 2000, 2001; Evans et al., 2001; Rudd and Franklin-Tong, 2001)。与其他大多数离子不同，钙不能在细胞内自由扩散(Trewavas, 1999)。植物有多个钙库，包括外质体、液泡、核膜、内质网(ER)、叶绿体和线粒体。因此，每个刺激都能诱发一个特征性Ca² 波动，通过具体地改变各种不同的部位的Ca² 通道，H /Ca² 逆向转运蛋白，Ca² 和H 离子泵((Bush, 1995; Thuleau et al., 1998; Allen et al., 2000; Hwang et al., 2000; Harper, 2001)。不同的钙传感器识别特定的钙信号，并将其转化为下游效应，包括蛋白磷酸化状态的改变和基因表达模式((Sanders et al., 1999; Rudd and Franklin-Tong, 2001)。

在植物中，有好几类已知的Ca² 结合蛋白，包括钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶(CDPKs)和类钙调磷酸酶B蛋白。其中，CDPKs的特性最佳，也特别令人感兴趣。它们代表了一种新的在单一多肽中具有蛋白激酶和钙调蛋白结构域的Ca² 传感器。因此，CDPKs可以直接与钙结合，它们的钙刺激激酶活性独立于钙调蛋白，不同于钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶(CaMKs; Roberts and Harmon, 1992)。目前已知的大部分植物钙刺激蛋白激酶活性与CDPKs有关。通过对拟南芥CDPKs基因的全基因组分析，我们可以了解这个多基因家族的多样性，并有助于阐明其功能。可能在基因复制和随后的进化中产生了具有冗余和不同功能的CDPKs。此外，单个CDPKs的功能特异性可能取决于转录和翻译后水平的调控，以及靶向亚细胞区隔化、钙和脂质敏感性和底物识别。

拟南芥CDPK基因家族

早在20年前，人们就在豌豆(Pisum sativum)提取物中第一次发现了钙依赖、钙调素独立的蛋白激酶活性(Hetherington and Trewavas, 1982)。自从它们最初从大豆(Glycine max)中被纯化和表征(Harmon et al., 1987)，CDPKs已经在从绿藻到被子植物的植物界中被发现((Hrabak, 2000; Harmon et al., 2001)。

除植物外，CDPKs仅存在于一些原生动物中，而在已测序的真核生物中明显缺失，如酵母(Saccharomyces cerevisiae)、线虫((Harmon et al., 2000)、果蝇(Drosophila melanogaster; Adams et al., 2000)和人类(Homo sapiens; International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Venter et al., 2001)。对拟南芥基因组序列的分析表明，存在34个CDPK基因(The Arabidopsis Genome Initiative, 2000)。有限的基因组测序以及一些广泛的表达序列标签(EST)项目提供的信息也表明，CDPKs多基因家族存在于其他植物中，包括大豆、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)和玉米 (Zea mays; Harmon et al., 2001)。

结构域

四个不同的域构成了CDPK家族成员:一个N端可变域，一个蛋白激酶结构域，一个自抑制结构域，和一个类钙调蛋白域(图1)。系统发育分析的结果认为CDPK基因家族的出现是通过钙调蛋白激酶和钙调蛋白的融合(Harper et al., 1991; Suen and Choi, 1991; Harmon et al., 2000; Zhang and Choi, 2001)。这种独特的分子结构允许Ca² 直接激活CDPKs。与类似的哺乳动物蛋白多亚基CaMKII不同，CDPKs作为单体发挥作用(Roberts and Harmon, 1992)。

图 1. 哺乳动物CaMKII和植物CDPKs的结构比较。CDPKs的激酶结构域与小鼠(Mus musculus)CaMKIIalpha;(登记号no.S04365)同源性高达44%（相似性65%）和CaMKIIbeta;(登记号 no.NP_031621)同源性43%（相似性65%）。

N，氨基端可变域；K，激酶结构域；A，自抑制结构域；CaM，钙调蛋白。在类钙调蛋白域的四个条表示EF-hand Ca² 结合位点·。

对34个拟南芥CDPKs的预测氨基酸序列比对显示，激酶结构域(44% ~ 95%同源性和60% ~ 98%相似性)、自抑制结构域(23% ~ 100%同源性和42% ~ 100%相似性)和类钙调蛋白结构域(27% ~ 97%同源性和50% ~ 98%相似性)高度保守，而N端可变域几乎没有序列相似性。(所有34个拟南芥CDPKs的氨基酸序列成对比对可在http://xanadu.mgh.harvard.edu/sheenweb/index.htm网站上。通过选择“拟南芥CDPKs”查看)激酶结构域(264-273个氨基酸长)包含典型的真核丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的所有12个高度保守的亚结构域((Hanks and Hunter, 1995)。在所有34个拟南芥CDPKs中，活性位点几乎100%一致。以酪蛋白、组蛋白IIIS、或合成肽为底物，异种表达的CDPKs已被证明具有Ca² 体外刺激蛋白激酶活性(如Harper et al., 1993; Urao et al., 1994; Lee et al., 1998;Yoon et al., 1999)。位于亚结构域II内的一个绝对保守的Lys残基被认为是ATP结合位点，该残基的诱变使其失去了催化活性(Sheen, 1996)。

自抑制域是一个碱性氨基酸区域(31个氨基酸长)，其功能是作为假底物(Harmon et al., 1994)。34个拟南芥CDPKs中有16个在自抑制域中含有一个潜在的自磷酸化位点(Basic-X-X-S/T，其中X是任何残基)(Harmon et al., 1994)。这些CDPKs是否在这个位点发生自磷酸化还有待确定。尽管CaMKII类似部位的自磷酸化导致了一种组成活性酶不再依赖于Ca² (Schulman and Lou, 1989)，类似的磷酸化作用在调节植物CDPKs活性中起的作用还未确定(见下面的“磷酸化和去磷酸化调节”)。

类钙调蛋白结构域(94-147个氨基酸长)含有Ca² 结合EF手使蛋白质起到Ca² 传感器的作用。每个EF手由一个具有13个氨基酸残基的环组成，两侧是两个alpha;螺旋线。单个Ca² 分子通过环域与每个EF手结合(Zhang and Yuan, 1998)。EF手的数量取决于不同的亚型。大多数拟南芥CDPKs包含四个EF手，而少数有一个、两个或三个(表I)。EF手最保守的序列在位置1和2，最不保守的是位置4的手。不存在EF手的位置也各不相同。这些EF手的数量和位置上的差异可能会导致Ca² 结合部位变构特性和激活阈值的变化。EF手的连续缺失表明，EF手的数量可能对确定钙离子对CDPK活性的调节很重要(Hong et al., 1996)。此外，通过对每个EF手中高度保守的Glu残基的位点定向突变，表明EF手越接近自抑制域，其对Ca² 调控CDPK活性的影响越大(Zhao et al., 1994)。

CDPK活性的调节主要通过激酶、自抑制和类钙调蛋白结构域之间的相互作用来控制。在低游离Ca² 的基础条件下，自抑制结构域与激酶结构域结合，保持底物磷酸化活性低。在Ca² 结合EF手基序后，CDPKs发生构象变化，从催化位点释放假底物，激活蛋白质(Harmon et al., 1994; Harper et al., 1994)。仅删除类钙调蛋白结构域会产生一种不能被Ca² 激活的非活性酶，然而，自抑制和类钙调蛋白结构域的缺失会产生一种组成性活性的Ca² 不敏感酶，这一观察结果支持了上述模型(Harper et al., 1994; Sheen, 1996)。

我们对N端可变域的功能知之甚少。有人提出该区域包含亚细胞靶向信息(Schaller and Sussman, 1988; Harper et al., 1994; Hrabak et al., 1996)。据报道，CDPKs与各种膜相关(Ellard-Ivey et al., 1999; Martin and Busconi, 2000; Lu et al., 2001; Lu and Hrabak, 2002)。然而，34个拟南芥CDPKs中没有一个被预测为完整的膜蛋白。CDPKs的N端前导序列不仅在氨基酸序列上有变化，而且在长度上也有变化，在拟南芥中从25个(AtCPK11)到近200个(AtCPK2)氨基酸不等(表I)。尽管在N端结构域内存在这种变化，但大多数拟南芥CDPKs在第2位有一个甘氨酸残基。当放在一个适当的环境中，N端甘氨酸残基被肉豆蔻酸（一种C 14:0的脂肪酸）共价结合修饰(Towler et al., 1988)。在许多系统中，N-肉豆蔻酰化可促进蛋白-膜和蛋白-蛋白相互作用(Johnson et al., 1994)。N端Gly的突变则没有了这种脂质修饰，从而阻止了膜的结合(Martin and Busconi, 2000)。24个拟南芥CDPKs被预测具有N -豆蔻酰化基序，用于膜连接(表I)。然而在其中只有AtCPK2已被实验证明N基末端Gly残基被豆蔻酰化，第一个10个氨基酸是定位在ER膜上的关键(Lu and Hrabak, 2002；表I)。这种脂质修饰也在其他四种植物的CDPKs中发生，与拟南芥相似，其中两种蛋白被发现与膜相关(Farmer and Choi, 1995; Ellard-Ivey et al., 1999; Martin and Busconi, 2000; Raıacute;ces et al., 2001)。AtCPK 5和6预计不会被肉豆蔻酰基化(表I)，但部分与细胞膜有关(Lu et al., 2001)，这表明其他机制(如糖基化)可能是它们亚细胞定位的原因。

肉豆蔻酸残基的加入并不足以使膜连接。通常，第二种脂质修饰，如棕榈酰化(添加棕榈酸盐，一种C16:0脂肪酸)，是稳定膜的相互作用所必需的。所有24个预测有肉豆蔻酰化共有序列的ATCPKs在3、4或5位至少有一个Cys残基(表I)，这是一个潜在的棕榈酰化位点(Milligan et al., 1995)。最近，实验表明，N端Gly的肉豆蔻酰化和4、5位Cys残

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