斑马鱼意识紊乱等位基因不同严重程度胰腺缺陷的全基因组表达分析鉴定了Putative Notch应答基因外文翻译资料

斑马鱼意识紊乱等位基因不同严重程度胰腺缺陷的全基因组表达分析鉴定了Putative Notch应答基因

作者: Ashok Hegde1 , Nick Chuanxin Qiu1., Xuehui Qiu1., Steven Hao-Kee Ho1., Kenny Qi-Ye Tay1., Joshy George2 , Felicia Soo Lee Ng3 , Kunde Ramamoorthy Govindarajan2 , Zhiyuan Gong4 , Sinnakaruppan Mathavan2 , Yun-Jin Jiang1,5,6*

单位: 1 Laboratory of Developmental Signalling and Patterning, Institute of Molecular and Cell Biology, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), Singapore, Singapore, 2 Genome Institute of Singapore, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), Singapore, Singapore, 3 Bioinformatics Institute, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research), Singapore, Singapore, 4Department of Biological Sciences, National University of Singapore, Singapore, Singapore, 5Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore, Singapore, 6 School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore, Singapore

摘要：

背景：Notch信号通路是一种进化上保守的发育通路。斑马鱼 mib突变体携带mib基因的突变，它编码一个通过Delta / Jagged泛素化和内化激活Notch所需的RING E3连接酶。方法/主要研究结果。我们利用胰腺特异性GFP株系的原位杂交和GFP表达分析对胰腺发育缺陷的mib突变体进行了检测，对3种不同mib突变体等位基因进行了全基因表达谱分析，并利用实时荧光PCR和荧光双原位杂交对芯片数据进行了验证。我们的研究表明，mib突变体的胰腺外分泌减少，这种缺陷最严重的是mibta52b，其次是mibm132，然后是mibtfi91，这与相应mib突变体等位基因的Notch活性受损相一致。对mib突变体的整体表达谱分析表明，基因expr存在显著差异

1引言

Notch通路是一个进化上保守的信号转导级联反应，在多种发育过程中起着至关重要的作用，如模式形成、细胞命运决定以及通过局部细胞-细胞相互作用形成器官等(文献[ 1 - 2 ]综述)。Notch信号除了对正常发育有重要作用外，还与多种人类先天性疾病有关，如T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤[ 3-5 ]、Alagille综合征[ 6-8 ]、迟发性神经系统疾病( 大脑常染色体显性动脉病合并皮层下梗塞及脑白质病 ) 、脊椎肋骨发育不全等。

Notch受体作为一种膜结合的转录因子，在响应触发配体结合的生理信号时启动特定的基因。DSL ( Delta，塞拉特 / Jagged和Lag-2 )跨膜配体功能结合后，膜结合的Notch被TNFa-转化酶( TACE )、金属蛋白酶和早老素(暂定名)蛋白水解，活性形式- Notch胞内结构域( NICD ) -释放[ 12,13 ]。然后，NICD被转移到细胞核[ 14 - 17 ]，与保守的CSL ( CBF1 / RBPjk , Su ( H )和Lag-1 DNA结合蛋白[ 18,19 ]结合，后者由转录抑制因子转化为激活剂。这就触发了下游靶基因如bHLH转录因子Hes / Her ( 毛发 /增强分裂相关 )家族的表达，进而调控下游基因及其自身的表达[ 16,20 - 26 ]。

一些E3连接酶如Mind轰炸( Mib )、Su ( dx )、Sel-10、Neuralized和Deltex等已被证明通过泛素依赖的蛋白降解和/或内吞作用来调节Notch信号[ 27,28 ]。Mib是一种泛素连接酶，通过控制Delta蛋白的内化而非自主地要求细胞进行Notch信号和侧抑制。斑马鱼Notch信号元件的几个突变体，如8 ( aei ) / DeltaD、致命7 ( des ) / Notch1a、Beamter ( bea ) / deltaC、头脑炸弹( mib )等已经在大规模筛选中被分离[ 24、 27、 29 ~ 32 ]。在所有这些突变体中，前体细胞正常形成但后体细胞不规则形成[ 29,30,33 ]。斑马鱼mib2基因最近被克隆。斑马鱼Mib和Mib2具有共同和特异的Delta底物，功能冗馀。本实验室已对Notch依赖表型严重程度下降的mib的三个不同等位基因，即mibta52b，mibm13 mibtfi91进行了鉴定。

小鼠和斑马鱼[ 37-40 ]的遗传学研究表明Notch信号参与胰腺发育。缺乏Notch信号成分的小鼠，Dll1、RBP-jk和Hes1，内分泌胰腺细胞增多，祖细胞减少[ 36,41 ]。一些Notch相关转录因子，如Ngn3 [ 42,43 ]、Isl1 、MafA 、Pax4和Pax6 [ 46,47 ]等在胰腺发育中的作用已被证明。然而，Notch信号的差异调节在胰腺发育中的作用尚不清楚。

微阵列是一种用于全基因组表达谱分析的有用方法。利用该方法，已报道了多个参与调控小鼠胰腺发育的信号通路下游基因[ 49,50 ]。继此类微阵列分析的线索之后，一种新的转录因子Myt1 被证明参与胰腺发育。同样，Mellitzer等人也表明一种新的转录因子IA1受Ngn3的调控，需要内分泌胰腺细胞的正常分化。为斑马鱼建立了高密度的微阵列，并记录了胚胎发育过程中的转录组图谱。此外，利用基因芯片技术在斑马鱼中鉴定出了新的参与声刺猬信号通路的靶基因。然而，Notch信号缺陷突变体的全基因组分析尚未见报道。

因此，我们进行这项研究有三个主要目标，即( 1 )利用原位杂交和胰腺特异性GFP表达分析，检测胰腺缺陷的3个mib突变等位基因，了解Notch信号差异激活对胰腺发育的影响；( 2 )通过基因芯片分析，鉴定wt斑马鱼与3个不同mib突变等位基因之间的差异调控基因；( 3 )鉴定和验证参与胰腺发育的Notch响应基因。通过我们目前的工作表明，mib突变体的外分泌胰腺发育减少，这种缺陷在mibta52b最为严重，其次是mibm132和mibtfi91。利用微阵列分析，我们已经鉴定了几个特征基因，以及潜在参与胰腺发育的新基因/ EST。实时PCR和荧光双原位杂交对代表性基因的验证支持了芯片数据。此外，本研究还产生了有用的基因组资源，确定了一些可能在Notch调控的发育过程中发挥重要作用的未定型ESTs /基因。

结论

mib突变等位基因存在胰腺缺陷

我们对4天受精后( dpf ) mib突变体及其野生型( wt )兄弟姐妹的4个胰腺特异性基因进行了原位杂交(图1 )。在mib突变体中，胰腺外分泌特异性基因elastaseA ( 图 1A和 1A9 - 1D9 )和胰蛋白酶( 图 1E和 1E9 - H9 )的表达降低。与它们在wt胚胎中的表达量相比，这两个基因在mibta52中的表达量下调幅度最大，其次是mibm132，然后是mibtfi91，下调幅度较小。这一观察与这些mib突变体中Notch活性的降低相一致。我们还分析了elastaseA - GFP在4 - dpf mib突变体及其野生型兄弟姐妹中的表达(图2A - 2D )。在mib突变体中，elastaseA - GFP的表达随着Notch活性的降低而降低，这与我们的原位杂交( 图 1A和 1A9 - 1D9 )结果一致。

图1 . mib突变体及其野生型( wt )兄弟姐妹96 hpf胰腺特异基因的表达模式。原位杂交所用的RNA探针有( A和 A9 - D9 )弹性蛋白酶A、( E和 E9 - H9 )胰蛋白酶、( 我和我 9 - L9 )生长抑素和( M和 M9 - P9 )胰岛素。基因型为( A , A9 , E , E9 , I , I9 , M和 M9 ) wt、( B9、 F9、 J9和 N9 ) mibtfi91、( C9、 G9、 K9和 O9 ) mibm132和( D9、 H9、 L9和 P9 ) mibta52b。A9、E9、I9和M9分别从A、E、I和M中收获。所有面板均为侧视，右前方。

我们进一步分析了三种内分泌胰腺特异性基因，生长抑素( d细胞特异性)、胰岛素( b细胞特异性)和pdx1 (胰腺祖细胞特异性)的表达。4 - dpf mib突变体中生长抑素(图1I和1I9 - 1L9 )和胰岛素( 图 1M和 1M9 - 1P9 )水平略有升高。mib突变体中的胰岛素- GFP (图2E和2E9 - 2H9 )和pdx1 - GFP ( 图 2I和 2I9 - 2L9 )的表达分析也表明，这些基因相对于它们在wt胚胎中的表达略有上调。

全基因组表达谱分析我们对mib突变体在受精后24h、48h和72h三个不同阶段进行了全基因组表达谱分析。通过72 hpf胚胎的微阵列分析，我们鉴定了mibta52b突变体( 表 S1 , q = 0.0 )中1128个上调和936个下调基因；mibm132突变体( 表 S2 , q = 0.0 )中1464个基因上调，2210个基因下调；mibtfi91突变体中2081个基因上调，2538个基因下调(表S3，q = 0.0 )。利用PERL脚本，我们进一步鉴定了每个突变等位基因特异且共同存在于所有3个mib突变等位基因的差异表达基因(图3 )。在上调基因列表中，mibta52b、mibm132和mibtfi91突变等位基因特异的基因数目分别为93、287和768个；在下调基因列表中，mibta52b、mibm132和mibtfi91等位基因特异的基因数目分别为33、557和874个(图3A和3B，表S5、S6和S7，q = 0.0和score ( d ) . 4.0 )。这些差异表达的基因大部分是未鉴定的基因或EST (表1 )。3个mibmutant等位基因共有91个基因，其中上调31个，下调60个( 图 3A和 3B ,表 1 )。在这91个基因中，只有27个基因先前被鉴定，64个为未鉴定基因或EST ( 表 1 ,表 S4 , q = 0.0和评分 ( d ) . 4.0 )。在这91个基因中，只有27个基因先前被鉴定，64个是未鉴定的基因或EST ( 表 1 ,表 S4 , q = 0.0和评分 ( d ) . 4.0 )。聚类树视图显示了这91个基因的表达谱：上调基因在红色，下调基因在绿色(图4 )。我们进一步根据已知的功能或预测的功能将这91个常见基因按其与小鼠和人的同源序列进行分类(表S4 )。在27个特征基因中，有6个上调基因，包括dab2、mcl1a、mcl1b、fn1l、ttn和nppa，21个下调基因，包括pbx3b、gpm6aa ( BI840762 )、olig2、tfdp2、rpl13、gpm6aa ( BI839927 )、atp1a1b、fabp7a、gpm6aa ( BG306150 )、fkbp5、gfap、opn1sw1、opn1sw2、opn1mw1、vsx1、pou50、mdkb、tal1、dla、vamp2和her4。

图2 .弹性蛋白酶A-GFP、胰岛素-GFP和pdx1 - GFP在mib突变等位基因及其wt兄弟姐妹胚胎中的表达。在96hpf时分析了弹性蛋白酶AGFP在( A ) wt、( B ) mibtfi91、( C ) mibm132和( D ) mibta52b胚胎中的表达。72hpf分析胰岛素- GFP在( E和E9 ) wt、( F9 ) mibtfi91、( G9 ) mibm132和( H9 ) mibta52b胚胎中的表达。在72hpf时，分析pdx1 - GFP在( I和I9 ) wt、( J9 ) mibtfi91、( K9 ) mibm132和( L9 ) mibta52b胚胎中的表达。面板A-D为侧视，其馀为背侧视，朝向右前方. doi：公共科学图书馆 / journal . pone . 0001479 . g002

图3 . Venn图显示了属于不同类群的基因数目。每个mib突变等位基因特异的差异表达基因，2个突变等位基因之间共有，3个突变等位基因之间共有，在72 hpf时分别是( A )上调和( B )下调；并且( c )在48Hpf时上调和( D )下调；在mibta52b突变体中，与每个时间点特异、两个时间点共同和三个时间点共同的基因( E )上调和( F )下调。以q = 0.0和score ( d )为标准选取72 - hpf数据进行基因集分析；对于48 hpf数据的分析和mibta52b突变体的3个时点数据均基于该判据选取，q = 0.0 . doi：公共科学图书馆 / journal . pone . 0001479 . g003

利用相同的PERL脚本，我们分析了3个mib突变等位基因的48 -

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