WUSCHEL在植物体内引发天然抗病毒免疫干细胞外文翻译资料

WUSCHEL在植物体内引发天然抗病毒免疫干细胞

Haijun Wu¹, Xiaoya Qu¹, Zhicheng Dong², Linjie Luo¹, Chen Shao¹

, Joachim Forner^3*,Jan U. Lohmann³, Meng Su¹, Mengchu Xu¹, Xiaobin Liu², Lei Zhu⁴, Jian Zeng¹, Sumei Liu¹,Zhaoxia Tian¹dagger;, Zhong Zhao¹dagger;

摘要：植物中的干细胞不断提供子细胞以形成新的器官，并有望保护细胞的完整性免受生物的入侵。本文主要展示了拟南芥的干细胞如何通过顶端分生组织及其新生子细胞抑制黄瓜花叶病毒（CMV）的感染。干细胞调节因子WUSCHEL对CMV感染做出反应，并抑制积累分生组织中央及外围区域的病毒。WUSCHEL通过抑制植物S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性来抑制甲基转移酶的表达。这些甲基转移酶参与核糖体RNA加工和维护核糖体稳定性。我们的研究结果揭示了一种保护植物的策略，用来保护干细胞免受病毒入侵，并为WUSCHEL介导的植物广谱天然抗病毒免疫提供分子基础。

植物干细胞及其在茎尖新分化的子细胞分生组织（SAM）在胚胎后期为所有地上器官提供细胞发展所需的条件^[1]。这种组织防止病毒入侵。事实上，从受感染的植物和植物中，分生组织顶端培养来清除病毒被广泛用于培育脱毒品种^[2]. 在这里，我们分析了用广谱数据保护SAM中多能干细胞免于受病毒侵袭的抗病毒机制。为了验证假设SAM是无病毒的^[3]，我们在用黄瓜花叶病毒接种叶片后，观察了病毒在拟南芥SAM中的分布（CMV）（图1A）。接种后9天（dpi），我们观察到CMV在枝条和肋区有积累地情况发生，但在中心区（CZ）、外围区（PZ）或花原基（图1，B到D，图S1和S2）则没有积累情况产生。我们在WUSCHEL（WUS）^[4,5]表达域下方观察到CMV积累（图1、E和F）。在L2细胞层异位有表达WUS^[6-8]的clv3-7突变体（图1G），CMV向上移动并保持在含有WUS蛋白的细胞下方域（图1H和图S3）。然后我们研究了WUS表达域是否可以阻止病毒移动，或者WUS是否可以抑制病毒积累。我们产生了一个具有扩大的SAM功能的mp clv3-7双突变体，这许我们能够将CMV直接接种到WUS表达域下方（图11）。我们进行了一项基于连续切片的错配分析，其中一部分用于检测检测WUS表达和相邻切片以检测CMV。虽然病毒直接接种到L1单元层的干细胞和L2细胞层的组织中心（OC）WUS蛋白所在位置上，但我们观察到CMV仅会传播在L2层下（图1，J和K），这则表明了含有WUS蛋白的区域，包括干细胞和OC，其余则对CMV入侵具有抗性。

为了检测WUS蛋白是否参与宿主对病毒的防御，我们使用wus/pCLV3在第九天中检测到CMV感染期间的WUS蛋白分布模式。在无病毒植物中，WUS蛋白表达与CLV3转录表达重叠在干细胞中（图2，A至D）。CMV侵袭时，WUS蛋白表达有增加（图2，E,G和H、图S4），但转录表达（图S5）没有增加。WUS蛋白在整个PZ和幼体花原基的模式与芽尖的CMV分布互补（图1D）。

图1。植物干细胞及其后代对巨细胞病毒感染具有免疫力。（A） 接种CMV在拟南芥中引发系统性感染。（B至D）模拟（B）、4 dpi（C）和9个dpi（D）工厂。红色框表示山姆上校-0，哥伦比亚-0。（E和F）CMV（E）和WUS（F）分布在9 dpi的SAM中。（G和H）clv3-7突变体中的WUS和CMV积累模式。（I至K）WUS（J）CMV（K）在病毒感染的mp clv3-7双突变体中的分布（I）。红线表示外科手术切开山姆红箭头.

在植物中，WUS可通过地塞米松（DEX）治疗[pUBQ10::WUS-GR植株^[9]]，我们接种CMV 后1天进行诱导WUS。在没有诱导的情况下，89%的植物将被病毒感染。在DEX诱导的WUS活性下，90%的植物将免于CMV入侵（图2，I至L）。为了确定干细胞的抗病毒能力是否需要WUS蛋白，我们使用wus/pWUS::wus链接器GFP/pCLV3::AlcR/pAlcA:;NSlmb-vhhGFP4植物进行诱导降解干细胞中的WUS蛋白^[9]. 乙醇诱导降低了SAM中的WUSlinker–绿色荧光蛋白（GFP）信号，在这种植物中，CMV侵入了SAM CZ和PZ（图2，M到T和图S6）。因此，干细胞调节因子WUS在抑制CMV感染中发挥作用。

WUS在抗病毒免疫中的作用不依赖RNA沉默（图S7至S9），自噬（图S10）或植物激素（图S11）途径，但是WUS确实可以导致了烟叶中的蛋白质沉默（图S7）。WUS是否作为转录因子参与在这种背景下，我们共同表达了35S::WUS-GR和35S::GFP，并观察到GFP只有当基因易位时才会进行沉默诱导WUS（图S12A）。我们还发现转基因沉默的效率取决于WUS-GR的剂量（图S12B）。WUS盒（m1）和EAR样基序（m3）中进行突变，而不是酸性区域基序（m2）中进行突变，消除了WUS在GFP沉默中的功能（图S13，A到F，I和J）。此外，我们融合了C具有SRDX抑制的WUS-m1末端VP16激活域和观察到的WUS-m1中GFP沉默的恢复-SRDX，但不在WUS-m1-VP16中（图S13，G至J） 这表明WUS是一种转录抑制因子，可以用来抑制GFP的积累。

为了研究WUS是否可以通过加速蛋白质降解或抑制蛋白质合成来抑制蛋白质的表达积累，我们则使用蛋白酶体抑制剂MG132。烟叶中MG132的使用抑制了GFP的降解，从而使GFP积累。然而，随着WUS的加入，GFP并没有改变累积（图S14A）。同样，在拟南芥中，用MG132治疗不影响WUS介导的GFP在pUBQ10::WUS-GR；35S::GFP植物的降解（图S14、B和C）。因此，WUS抑制蛋白质合成，而不是促进蛋白质降解。

图2。WUS蛋白对巨细胞病毒有应答并抑制病毒感染。

（A至H）WUS蛋白分布wus/pWUS::wus-GFP中的CLV3表达模式；pCLV3::mCherry NLS救援工厂，带[（E）至（H） 或在第9天时无[（A）至（D）]CMV感染（n=15）。（I和J）在pUBQ10中第8天时的CMV累积：有（J）或没有（I）DEX诱导的WUS-GR植株持续7天。（K） 受病毒感染的植物的百分比在第8天i时进行（n=159）或不进行（n=117）DEX治疗。（五十） WUS抑制CMV基因组RNA在第8天下通过RNA凝胶杂交测定SAM中的累积。（M到T）WUS连接器–GFP信号和wus/pWUS::wus连接器GFP/pCLV3::AlcR/pAlcA::NSlmb-vhhGFP4线路中的CMV分布在0 dpi[（Q）至（T）]和8 dpi[（M）至（P）]条件下，不使用1%乙醇治疗48小时，并伴有CMV感染。刻度尺，50毫米英寸（A）至（H）和（M）至（T）和100毫米英寸（I）和（J）。

为了检测WUS对病毒蛋白质合成的影响，我们将GFP融合到每个CMV蛋白2a、3a、CP和2b的C末端^[10]。我们在烟叶中将这些构建体与35S::WUS共同过滤。3aGFP、2a-GFP、CP-GFP和2b-GFP的表达降低通过与35S::WUS共过滤而降低[如荧光和蛋白质印迹分析（图3，A至C）]。为了确定WUS是否抑制拟南芥中CMV蛋白的积累，我们用CMV接种了pUBQ10::WUS-GR植物，然后再用DEX处理诱导。在第8天时，SAM中的2b蛋白丰度增加降低（图3D）。为了阐明WUS是否介导蛋白抑制病毒是否具有特异性，或者是否对人体有全球影响蛋白质合成，我们跟踪加入0-炔丙基-嘌呤霉素以评估pUBQ10::WUS-GR植物中的新生蛋白质水平^[11,12]。 DEX诱导三天后，我们在pUBQ10::WUS-GR植物中总新生蛋白质含量降低（图3，E和F），但对照植物（图S15）则没有，我们观察到与放线菌酮处理一致（图3、E和F）。因此，在烟草和拟南芥中，WUS抑制CMV蛋白积累，并抑制整体蛋白合成。

图3。WUS抑制植物中CMV蛋白的积累。（A） 巨细胞病毒蛋白质3a（35S::3a GFP）、2a（35S::2a GFP）、CP（35S::CP-GFP）和2b（35S::2b GFP）35S::WUS共过滤4天后，在烟叶中被抑制。（B） 定量测定（A）中GFP的相对荧光强度（n=5）。（C） 西部的（A）中CP和2b蛋白的印迹。（D） WUS抑制CMV 2b蛋白积累在拟南芥的SAM中，第8天。（E和F）WUS全面抑制新生蛋白质在拟南芥（E）中合成，相对荧光强度在（F） 。（ngt;7）。35S：：GUS被用作阴性对照。CHX，环己酰亚胺；迪帕，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；OP-P，邻炔丙基嘌呤霉素。刻度尺，50毫米英寸（A）和100毫米英寸（E）**Plt;0.01，***Plt;0.001，不成对，双尾.

为了研究WUS是如何抑制蛋白质合成的，我们分析了DEX诱导的pUBQ10::WUS-GR植物顶端的基因表达无CMV感染。我们鉴定了11个参与蛋白质合成调节的基因，包括7个S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性甲基转移酶，预测他们会调节RNA甲基化（图S16）。我们使用定量进行逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检查了这些（图S17A）和12种其他已知的MTase（图S17B）。其中六个基因被WUS抑制并上调在wus-6突变体中（图S17，A至C）。五个酶含有WUS DNA结合基序。事实上，我们通过染色质免疫沉淀和电泳迁移率转移分析发现，WUS在体内和体外都与MTase启动子相关（图S17，D至I），表明抑制MTase的转录。

在这些五个MTase基因中，只有单核苷酸蛋白质2A（NOP2A，AT5G55920）显示PZ中的表达（图S18），其表达被CMV感染抑制（图S19）。因为NOP2A及其同系物NOP2B，据预测是MTASE造成的m525S核糖体C2860的m⁵C甲基化RNA（rRNA）^[13-15]，我们评估了总的m⁵C水平。我们观察到nop2a/NOP2B降低转基因植物RNA干扰（RNAi）（图4A），我们用液体进行了确认色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量（图4B）。核糖核酸免疫沉淀显示m⁵C-修饰25S rRNA在大肠杆菌中富集。C2860nop2a/NOP2B中的野生型植物较少有RNAi植物（图4C），证明NOP2A和NOP2B在m⁵C甲基化中起冗余作用。使用RNA亚硫酸氢盐测序，我们量化了25S rRNA的m⁵C水平，并观察到nop2a/NOP2B RNAi植物中未甲基化的C2860增加了64%（图4D）。

rRNA甲基化稳定了rRNA加工和加强了核糖体结构^[16]。在MTase中在突变体中，我们观察到rRNA前处理受到干扰，并且rRNA中间产物增加（图S20），这与WUS过度积累植物有关（图S21）。通过多聚体分析，我们观察到，在植物中80s和60S核糖体的水平在处理后降低激活WUS（图4E和图S22）。因为NOP2A在干细胞中被WUS抑制，我们观察到与WUS一致的区域中的干细胞蛋白质结构域（图4F）新生的蛋白质合成较少。虽然AT3G54150、AT1G69523和AT1g55450目前尚不清楚，这三组中的80S和60S核糖体水平也降低突变体（图S23）。因此，WUS抑制核糖体组装至少部分是通过调节酶，在蛋白质合成方面导致全球范围内减少。

图4。MTase调解WUS触发了先天性抗病毒免疫。（A） 斑点杂交显示总共是m⁵C水平为nop2a/NOP2B降低RNA干扰植物。（B） LC–MS/MS对总m⁵C野生型的水平（重量）（n=7），nop2a（n=8），和独立的nop2a/NOP2B RNAi T1（n=17）植物。（C） m⁵C-RNA免疫沉淀4周龄WT的qRT-PCR检测（n=6）、nop2a（n=6）和独立nop2a/NOP2BRNA干扰T1植物（n=8）。这个25S#2区域包含预测的m⁵C目标25S rRNA的C2860。这个25S#1和18S#1区域用作负片控制。（D） 量化在25S rRNA m⁵C级重量为C2860英寸（n=2），

nop2a（n=2）和nop2a/NOP2B RNAi（n=4）植物使用亚硫酸氢钠测序。黑框表示C2860站点。（E） 基因的多聚体图谱10天龄pUBQ10：：WUSGR幼苗经2天的DEX（n=2）。（F） 不含嘌呤霉素的SAM.花序中的新生蛋白质合成（Puro）成立或与Puro和CHX治疗用作负片控制。普罗公司新生的蛋白质是主要在PZ中观察到和原始生物对WUS的补充蛋白质结构域。比例尺，50毫米。（G） 过度表达MTases的活性可阻断WUSmediated抗病毒免疫。在UBQ10:：WUS-GR背景下，在第8天和DEX诱导下感染CMV的MTases过表达系的茎尖用抗

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