拟南芥bZIP转录因子HY5对PFG1/MYB12基因在光和紫外光B辐射下的表达具有调控作用外文翻译资料

拟南芥bZIP转录因子HY5对PFG1/MYB12基因在光和紫外光B辐射下的表达具有调控作用

作者：RALF STRACKE¹*, JEAN-JACQUES FAVORY²*, HENRIETTE GRUBER²*, LUTZ BARTELNIEWOEHNER¹, SEBASTIAN BARTELS², MELANIE BINKERT², MARKUS FUNK², BERND WEISSHAAR¹ amp; ROMAN ULM^2,3

单位：¹Department of Biology, Chair of Genome Research, Bielefeld University, D-33594 Bielefeld, Germany, ²Faculty of Biology, Institute of Biology II, University of Freiburg, D-79104 Freiburg, Germany and ³Centre for Biological Signalling Studies (bioss), University of Freiburg, D-79104 Freiburg, Germany

摘要:植物通过合成和积累能吸收紫外线的黄酮醇来抵御潜在的紫外线B辐射。这一生物合成途径的调控主要是转录和转录因子网络的控制，其中类黄酮醇糖苷(PFG)家族转录因子R2R3-MYB最近被发现具有关键功能。在此，我们利用全基因组转录谱描述了拟南芥幼苗在苯丙素途径基因水平上对窄带UV-B辐射的响应，并鉴定了在UV-B作用下积累的相应黄酮醇苷。我们的研究进一步表明，在UV-B和可见光下，PFG1/MYB12和PFG3/MYB111基因的转录激活需要bZIP转录调控元件ELONGATED HYPOCOTYL5(HY5)。植物中含有VP16激活结构域的HY5合成蛋白足以激活PFG1/MYB12的表达。然而，尽管myb11 myb12 myb111三重突变体在黑暗和持续光照下都显著降低了CHS水平，但无论光照还是UV-B诱导能力似乎都没有受损。尽管如此，缺失3个PFG家族转录因子导致UV-B耐受性降低，而PFG1/MYB12过表达导致耐受性增加。因此，我们的数据表明，HY5依赖的PFG基因表达调控有助于建立UV-B耐受性。

关键词：非生物胁迫；黄酮类化合物；基因表达；MYB12；UV-B耐受。

1引言

植物需要仔细地监测和响应它们的光环境，并将这一信息与它们的发育相结合。作为光自养生物，光是其最终的能量来源，但同时也是重要的环境胁迫因素。作为回应，植物会分泌与防御相关的次生代谢物。再加上它们在生长和发育过程中的高可塑性，这是它们进化成功、固着生活方式的关键特性。类黄酮是一类具有广泛生物功能的二级产物，包括应激保护(Winkel-Shirley 2002)。它们的合成和积累受到发展和环境的调控(Taylor amp; Grotewold 2005)。事实上，光是调节类黄酮生物合成的最重要的环境因子之一(Jenkins 2008)。

对植物的光胁迫不仅表现为低光胁迫或高光胁迫，还表现为对植物有害的紫外线(UV)-B辐射。为了减少UV-B接触敏感大分子，植物利用沉积在表皮细胞液泡中的黄酮类化合物来屏蔽这部分阳光光谱。因此，黄酮类化合物的重要作用在于其吸收紫外线的特性，能够屏蔽破坏性的UV-B辐射(例如Li et al. 1993;Kootstra 1994;Ryan等人2001年; Casati amp; Walbot 2003)。为此，黄酮类化合物通常存在于叶片的表皮细胞层和对UV-B辐射敏感的组织中，如花粉(Hsieh amp; Huang 2007)。类黄酮生物合成途径是一般苯丙素途径的一个分支，其第一步由查尔酮合成酶(CHS)催化(图1a)。查尔酮异构酶(CHI)、黄酮3-羟化酶(F3H)、类黄酮3-羟化酶(F3H)和类黄酮醇合成酶(FLS)进一步催化反应，生成碱性类黄酮醇山纳酚和槲皮素，这些物质被许多糖基转移酶进一步糖基化(Winkel 2006)(图1a)。这些黄酮醇苷是胁迫激活类黄酮生物合成途径的重要产物，具有抗氧化活性和较强的紫外吸收特性。

图1 拟南芥类黄酮生物合成途径及其受紫外线(UV)-B的调控。(a)拟南芥野生型幼苗类黄酮合成途径方案。uv - b诱导的基因被突出，pfg型MYB转录因子的靶基因被突出。(b)幼苗甲醇提取物的HPTLC分析显示黄酮醇糖苷积累水平和组成对补充UV-B照射所指示时间的响应。色键：绿色，山奈酚衍生物；橙色，槲皮素衍生物；淡蓝色，芥酸衍生物。鉴定结构名称：K-3R-7R，山奈酚-3 - O-鼠李糖苷 - 7 - O-鼠李糖苷；SG，芥子酰葡萄糖；K - 3G - 7R、Kaempferol - 3 - 葡萄糖苷 - 7 - O - 鼠李糖苷；Q-3G-7R，槲皮素-3 - 葡萄糖苷 - 7 - 鼠李糖苷；K-3 [ G-R ] -7R，山奈酚3 - O- [鼠李糖基-葡萄糖苷] -7 - O-鼠李糖苷；Q-3 [ G-R ] -7R，槲皮素3 - O- [鼠李糖基-葡萄糖苷] -7 - O-鼠李糖苷。4Cl，4 -香豆酸：Coa连接酶；C4H，肉桂酸- 4 -羟化酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查尔酮异构酶；F3H，黄烷酮3 -羟化酶；F3′H，类黄酮3′-羟化酶；FLS，黄酮醇合成酶；PAL、苯丙氨酸解氨酶；Ugt，Udp -依赖性糖基转移酶；DFR，二氢黄酮醇4 -还原酶；LDOX，隐花青素双加氧酶。

类黄酮生物合成途径的调控主要是在转录水平上，无论是调控因子还是生物合成基因(例如Quattrocchio et al. 2006; Jenkins 2008)。因此，在协调类黄酮生物合成的潜在转录调控网络中有大量的兴趣(Broun 2005;Lepiniec et al. 2006;Quattrocchio et al. 2006;Jenkins 2008)。这可以通过两种互补的方法来实现:(1)鉴定类黄酮合成相关基因启动子中的顺式调控元件；(2)确定调控这些启动子的转录因子。响应启动子中的顺式调节元件介导任何信号级联的末端步骤，导致转录重编程。尽管已知UV-B辐射在拟南芥中引起广泛的转录反应(例如，Ulm amp; Nagy, 2005年的综述)，但目前仅发现了少数几个需要顺式调控元件的UV-B响应启动子(Hartmann et al. 2005;Safrany et al. 2008)。CHS启动子代表了最好的研究例子之一。主要在瞬时表达系统中进行的研究表明，UV-B-和UV-A/blue诱导的CHS和苯丙烷类生物合成途径的其他基因的转录是由多个光调节单元(Kaiser et al. 1995; Hartmann et al. 1998, 2005)。这些LRUs由两种不同类型的顺式调控元件组成，即G-box相关元件(ACE^CHS核心序列- CACGT -)和MYB识别元件(MRE^CHS核心序列-ACCTA-)。这些元素表明了bZIP/bHLH和MYB转录因子家族中光响应成员的协同作用。

bZIP转录调节因子ELONGATED HYPOCOTYL5 ( HY5 )先前与CHS基因在可见光和UV-B 下的激活和黄酮积累有关(Ang et al. 1998; Oravecz et al. 2006)。同时，HY5蛋白能够在体外(Ang et al. 1998)和体内(Lee et al. 2007)结合CHS启动子序列。HY5确实是所有光照条件下正常发育的关键因素(Koornneef, Rolff amp;Spruit 1980; Chen, Chory amp; Fankhauser 2004; Ulm et al.2004; Brown et al. 2005).。在黑暗环境中，E3泛素连接酶组成型光形态基因1 (COP1)降解HY5蛋白(以及其他参与光调节转录的转录因子，包括HY5的同源基因HYH)，但在对光感知的反应中，这种降解被阻止 (Osterlund et al. 2000; Holm et al. 2002; Jiao, Lau amp; Deng 2007)。然而，HY5水平也受到发育调控，并在幼苗在光照下建立的头几天强烈下降(Hardtke et al. 2000)。然而，在对UV- B的反应中，HY5基因表达被重新激活，HY5蛋白重新积累，需要功能抗紫外线LOCUS8 (UVR8)和COP1 (Ulm et al. 2004; Brown et al.2005; Oravecz et al. 2006; Favory et al. 2009)。这对拟南芥幼苗中响应UV-B的类黄酮积累非常重要，也是UV-B耐受所必需的(Brown et al. 2005; Oravecz et al. 2006; Favory et al. 2009)。然而，HY5蛋白缺乏一些特征良好的bZIP转录因子的脯氨酸和酸激活域，并且它本身不能在酵母中激活转录(Ang et al. 1998)。最近，HY5染色质免疫沉淀(ChIP)结合微阵列分析确定了超过3000个染色体位点为HY5可能的结合靶点;然而，在体内，HY5与其目标启动子的关联在不同的光质量下或在光向暗的转变过程中没有改变(Lee et al. 2007)。因此，可以预见，HY5需要相互作用的伴侣，这些伴侣是由UV-B和其他光质并行诱导的。

MYB转录因子是一个由保守的MYB DNA结合域定义的蛋白质家族(综述于Stracke, Werber amp; Weisshaar 2001)。R2R3型MYB蛋白控制植物生长发育的多个方面，包括次生代谢。特别是最近有一个亚族被认为是植物发育过程中类黄酮合成的黄酮醇特异性激活剂，即由PFG1/MYB12、PFG2/MYB11和PFG3/MYB11组成的PFG家族SG7/PRODUCTION(Stracke et al. 2007)。事实上，PFG1/ MYB12被证明通过结合MRE^CHS元件来调节CHS的表达 (Mehrtens et al. 2005)。进一步发现PFG家族的三个MYB转录因子在黄酮醇通路特异性基因调控中具有重叠功能，但在器官特异性中发挥作用(Stracke et al. 2007)。与之一致的是，在标准生长条件下，三突变体myb11 myb12 myb111的幼苗不会形成黄酮醇，而花青素的积累则不会受到影响(Stracke et al. 2007)。

虽然类黄酮的生物合成控制提供了植物中较为详细的调控系统之一，但对环境输入途径的定义却少得多。例如，PFG型MYB转录因子的上游调控因子仍有待确定。在此，我们描述了UV-B响应类黄酮合成基因，并鉴定了UV-B在拟南芥幼苗中积累的类黄酮醇衍生物。这取决于bZIP转录因子HY5，我们发现具有合成激活域的HY5能够特异性地激活PFG1/ MYB12。我们进一步表明，myb11 myb12 myb111三重突变体对UV-B胁迫敏感，而MYB12过表达足以增加UV-B耐受。

2材料和方法

2.1植物材料及UV-B辐射

cop1-4, hy5-215和myb11 myb12 myb111突变体，以及myb12过表达系，属于哥伦比亚生态型(Col) (McNellis et al. 1994; Oyama, Shimura amp; Okada 1997; Mehrtens et al. 2005; Stracke et al. 2007)， Wassilewskija (Ws)中的hy5-ks50、hyh-1和hy5-ks50 hyh-1 (Holm et al. 2002)，Landsberg erecta (Ler)中的hy5-1/ProHY5:HY5-YFP (Oravecz et al. 2006)。用次氯酸钠对拟南芥种子进行表面杀菌，然后在Murashige和Skoog培养基(MS;Duchefa Biochemie B.V .， Haarlem， the Netherlands)含有1%的蔗糖和0.8%的琼脂，在4°C下分层至少2天，然后在24°C无菌条件下生长。

植株用欧司朗L18W/30管(3.6 mmol m^-2 s^-1;使用LI-250光度计进行测量，LI-COR Bio-sciences, Lincoln, NE, USA)辅以Philips TL20W/01RS窄带UV-B管(1.5 mmol m-2 s-1;用配备CX-312传感器的VLX-3W紫外线光表测量，Vilber Lourmat, Marne-laV alleacute;e，法国)。UV-B范围通过使用WG系列的3 mm传输截止滤波器进行调制，在指定波长(WG305和WG345;斯科特格拉斯沃克，美因茨，德国)。在WG345 (-UV-B)和WG305 ( UV-B)截止过滤器下连续照射幼苗4天。为了分析早期反应，将幼苗在没有UV-B的条件下生长4 d，在收割前1或6小时将WG345截止过滤器换成WG305截止过滤器。不同的处理被指定为96 h -UVB、1 h UVB、6 h UVB和96 h UVB(实验方案参见Oravecz等人2006

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