多根螺旋藻 Nramp 转运蛋白基因在镉积累中的作用外文翻译资料

多根螺旋藻 Nramp 转运蛋白基因在镉积累中的作用

原文作者：Yan Chen , Gaojie Li , Jingjing Yang

单位：中国科学院水生生物研究所

摘要：作为一种污染物，镉对环境造成严重影响并损害生物体。它可以被植物中的天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Nramp)从环境中吸收。然而，多根螺旋藻中Nramp转运蛋白基因的离子吸收功能尚未见报道。本研究在多根螺旋藻和酵母中克隆了SpNramp1、SpNramp2、和SpNramp3基因并研究其功能。经过在镉胁迫下测量野生型和转基因品系的生长参数和理化指标，结果表明，SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3被鉴定为质膜定位转运蛋白，并且在酵母中证实了它们在转运Cd中的作用。在多根螺旋藻中，SpNramp1过表达显着增加了Cd、Fe、Mn和鲜重的含量；SpNramp2过表达增加了锰和镉的浓度；SpNramp3过表达增加了铁和锰的浓度。这些结果表明SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3对离子吸收具有不同的偏好。此外还获得了两个多根螺旋藻转基因品系（OE1和OE3）。其中一种（OE1）表现出较强的积累能力，另一种（OE3）表现出对Cd的耐受能力。这项研究为SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3的功能提供了新视野并获得重要的转基因品系(OE1)用于控制Cd积累、植物修复和生态安全。

关键词：Nramp 转运蛋白基因；酵母；亚细胞定位；Cd 积累；植物修复

1、引言

随着工业快速发展和城市现代化，重金属污染已成为世界范围内的重大生态环境问题。。镉是所有生物体中毒性最大但非必需的重金属之一，广泛分布于水和土壤中；其主要来自采矿、冶炼和制造行业，然后被丢弃到农业和生态系统中。由于其高溶解度，它很容易在陆地和水生生态系统中积累，并通过物理接触或食物链对生物体造成不利影响。此外Cd 也很容易通过 Fe、Zn 和 Ca 等营养元素的运输通道被植物吸收。在植物中，过量的 Cd 不仅破坏基因组 DNA、叶绿体、线粒体和其他细胞器，还会降解大分子、诱导氧化并破坏代谢过程，如光合作用、抗氧化和蛋白质水解。因此，从环境中去除镉并进一步降低对生物体的毒性是极其重要的。

虽然已经可以采用物理和化学方法去除水生生态系统中的重金属，但是它们成本高，并且可能造成二次污染。而植物修复作为一种理想的方法，具有成本低、效率高、通过植物系统对环境友好等优点，可用于吸收和运输重金属，回收环境污染。Spirodela polyrhiza，也被称为多根螺旋藻，是在所有已测量的浮萍中，单子叶自由漂浮最大（1.5厘米长）同时基因组最小（158 Mb)的浮萍。以前的研究已经报道，浮萍适合用于植物修复。据报道，多根螺旋藻在不同种内的变异系有利于Cd植物修复中的应用。此外，随着多根螺旋藻基因组注释的改进，研究重金属吸收和转运中的分子机制变得十分便利。而在许多相关的生理学研究中，仍未有关于多根螺旋藻中Cd吸收、转运和积累的分子机制的探索。

Nramp是一种天然的抗性相关巨噬细胞蛋白，存在于从细菌到人类的所有物种中。它是一个高度保守的基因家族，与植物中Cd，Fe，Mn，As，Al和Zn的转运有关。在拟南芥中，AtNramp1是一种质膜定位蛋白，参与Fe，Mn和Cd的转运；.AtNramp2 是一种内膜定位蛋白，可转运 Mn；AtNramp3和AtNramp4是空泡膜定位蛋白，由缺铁诱导，AtNramp3 的过表达导致 Cd 超敏反应；AtNramp6位于高尔基体/-反式高尔基体网络中，该网络不仅涉及Cd运输，而且在调节缺Fe中发挥重要作用；然而，关于AtNramp5的详细报告很少。在水稻中，OsNramp1位于质膜中，与Cd胁迫和Fe缺乏有关；OsNramp2存在于排污体中，并将Fe从液泡输送到细胞质基质；OsNramp3 存在于质膜中，涉及 Mn 分布；OsNramp5位于质膜中，它涉及Cd和Mn的运输活动，并参与Mn的易位和分离；OsNramp6位于质膜中，输送Fe和Mn；OsNramp4 和 OsNRAT1（Nramp aluminum transporter1）与Al的运输有关。在东南景天中，SaNramp1位于质膜中，在Cd和Zn积累中起重要作用。在马卢斯胡椒中，MhNramp1的过表达与Cd摄取和积累有关。落花生中AhNramp1的过表达增强了对Fe的耐受性。

尽管已经进行了许多研究来阐明Nramp基因在不同物种中的作用，但不同的Nramp同源基因对金属离子转运具有不同的功能。因此，由于其功能多样性，应进一步探索Nramp基因。以多根螺旋藻作为研究对象除了其是一种理想的Cd植物修复植物，还有助于通过分子生物学研究Cd积累机制的发展。

为了更好地揭示SpNramp 转运蛋白基因（SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3）在Cd胁迫中的功能，我们将这些基因转入酵母突变体和多根螺旋藻中。在多根螺旋藻中分析了它们的表达水平、亚细胞定位、生长参数、离子含量（Cd、Fe和Mn）和超微结构。本研究揭示了SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3在Cd、Fe和Mn的运输和积累中的作用。透射电子显微镜(TEM)表明，高Cd浓度会破坏细胞结构并产生大量淀粉颗粒。我们的研究首次报道了Nramp转运蛋白基因在多根螺旋藻的Cd积累中的功能。这项研究为控制植物中的镉积累和植物修复提供了新的见解，并可能有助于改进其在水Cd污染中的应用。

2、材料和方法

2.1 SpNramp转运蛋白基因的克隆、遗传转化和阳性系的鉴定

在进行克隆前利用系统发育 (MEGA-X)、氨基酸序列(BioEdit)和相似性(http://www.detaibio.com/sms2/ident_sim.html)分析SpNramp转运蛋白基因的结构。从采集于中国武汉的多根螺旋藻的cDNA中克隆中得到SpNramp1(Spipo2G0094400)、SpNramp2(Spipo8G0025200)和SpNramp3(Spipo13G0011900)片段，使用酶消化连接方法或使用Trelief SoSoo克隆试剂盒（Tsingke Biological Technology，武汉，中国）连接，其中SpNramp转运蛋白基因的引物是使用Primer Premier 5生成的（表S1）。序列确定后，通过液氮冻融法将SpNramp转运蛋白基因重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中，使用叶转化系统通过以下方法将农杆菌融合质粒（OD6000.5-1）转移到多根螺旋藻中。(1) 取多根螺旋藻的叶，浸没在A. tumefaciens悬浮液中，在室温下真空渗透10分钟。(2) 28℃、180转/分接种30分钟，再次浸润10分钟。(3) 将它们转移到25℃、黑暗中的共培养基中培养3-5天，后在选择培养基中直接培养至少1个月。然后，对转化株系进行PCR扩增以确认阳性转基因株系。进行PCR筛选转化株系，筛选用的引物使用 Primer Premier 5 生成（表 S1）。在获得独立的转基因株系后，对本研究进行了一系列毒性实验。

2.2 植物材料和生长条件

在以下实验中使用了特定表达水平的SpNramp1、SpNramp2和 SpNramp3系（指定为 OE1、OE2 和 OE3）和野生型系（指定为 WT）。植物在1/2 MS培养基（含825 mg/L NH₄NO₃、950 mg/L KNO₃、85 mg/L KH₂PO₄、90.35 mg/ L MgSO₄, 166.1 mg/L CaCl₂, 0.83 mg/L KI, 6.2 mg/LH₃BO₃, 16.9 mg/L MnSO₄sdot;H₂O, 8.6 mg/L ZnSO₄·7H₂O, 0.25 mg /L Na₂MoO₄·2H₂O, 0.025 mg/L CuSO₄·5H₂O, 0.025 mg/L CoCl₂·6H₂O、36.7 mg/L FeNaEDTA、2 mg/L 甘氨酸、100 mg/L moy-肌醇、0.5 mg/L 烟酸、0.5 mg/L 盐酸吡哆醇、0.1 mg/L 硫胺素盐酸盐），光周期16 h/8 h（白天/黑夜）、光强度 85mu;mol m^-2s^-1在 25℃ /15℃ (日/夜)培养 7 天。挑选20片新鲜茎叶均一，绿色外观正常，无明显病斑、萎黄或坏死的植株；接种在烧杯中（直径70mm；高度99 mm），分别在 0、50、100和150mu;MCdCl₂条件下培养 7 天（Sigma-Aldrich，纯度 gt;99%）进行后续毒理学分析。每行的每个处理包括6个盆。然后，将收获的植物用蒸馏水冲洗三次，纸巾轻轻吸干。从三个盆中收集叶片并立即用于叶面积(ImageJ)、细胞膜穿透性 (Evans Blue)、H₂O₂分布（1% 3,3-二氨基联苯胺，DAB）的分析以及O₂分布 (0.1% 硝基蓝四唑, NBT)。另外三个盆的叶子用于分析生长参数和 Cd、Fe 和 Mn 的含量。

2.3 酵母互补测定

将SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3编码片段的基因分别插入到pESC 载体的Sal1、BamH1 和 Sal1 位点中（图S1B）。此外，他们的引物由 Primer Premier 5 设计（表 S1）。以下构建的质粒均转化入酿酒酵母菌株，包括用空载体转化的野生型（WT EV）、用空载体转化的Delta;ycf1（Delta;ycf1 EV）和用SpNramp1、SpNramp2和SpNramp3转化的Delta;ycf1（Delta;ycf1 SpNramp1、Delta;ycf1 SpNramp2 和 Delta;ycf1 SpNramp3）。选用酿酒酵母 BY4741 菌株（野生型；MATa；his3D1；leu2D0；met15D0；ura3D0）和Delta;ycf1（Cd 敏感突变体；MATa；ura3Delta;0；leu2Delta;0；his3Delta;1；met15Delta;0；YDR135c::kanMX4）来研究 SpNramp 转运蛋白基因在植物金属吸收中的作用。S. cerevisiae 菌株的培养采用Chen et al.(2017)中的方法并使用 LiAc/PEG/ssDNA 方法进行转化；后使用含有 2% 葡萄糖和不含尿嘧啶的氨基酸补充剂 (SD-ura) 的 SD 固体培养基选择转化细胞。

将pESC-SpNramp1、pESC-SpNramp2、pESC-SpNramp3、pESC-WT 和pESC-Delta;ycf1 酵母菌株，于30℃条件下液体 SD-ura 培养基中培养24小时呈单个酵母菌落(OD₆₀₀0.8-1)，并连续稀释至光密度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和 10^-5。然后，将稀释后的菌种接种在含有 2% 半乳糖、2% 琼脂和分别于0、50 和 75 mu;M CdCl₂条件下生长的Delta;ycf1的SD-ura 培养基中。用各种载体转化的 Delta;ycf1 菌株于pH6.0、分别添加20和 100 mu;M Cd² 的液体 SD- ura 培养基 (OD₆₀₀= 0.1)中培养30h。通过离心收获酵母细胞并用蒸馏水洗涤3次，所有细胞在 80℃下干燥3天，用8ml HNO₃消化，然后，使用电感耦合等离子体原子发射光谱 ICP-OES (Optima8000, PerkinElmer, USA)确定浓度。

2.4 SpNramp基因的亚细胞定位

亚细胞定位结果由在线服务器预测，即PSORT（https://psort.hgc.jp/），CELLO v2.5（http://cello.life.nctu.edu.

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