编码线粒体前序蛋白酶催化亚基PMPCB突变导致儿童早期神经病变外文翻译资料

编码线粒体前序蛋白酶催化亚基PMPCB突变导致儿童早期神经病变

作者：F.-Nora Vouml;gtle,1,17,* Bjouml;rn Brauml;ndl,2,17 Austin Larson,3,17 Manuela Pendziwiat,4,17Marisa W. Friederich,3,17 Susan M. White,5,6 Alice Basinger,7 Cansu Kuuml;cuuml;kkouml;se,1,8 Hiltrud Muhle,4 Johanna A. Jauml;hn,4 Oliver Keminer,9 Katherine L. Helbig,10 Carolyn F. Delto,11 Lisa Myketin,1Dirk Mossmann,1 Nils Burger,1 Noriko Miyake,12 Audrey Burnett,7 Andreas van Baalen,4Mark A. Lovell,13 Naomichi Matsumoto,12 Maie Walsh,14 Hung-Chun Yu,3,19 Deepali N. Shinde,15 Ulrich Stephani,4 Johan L.K. Van Hove,3,18 Franz-Josef Muuml;ller,2,16,18 and Ingo Helbig4,10,18,*

摘要：

导致儿童神经病变的线粒体疾病具有遗传异质性，在许多患病的个体中,潜在的遗传病因仍然是未知的。我们分别在在四个家庭的个体中发现了PMPCB的双等位基因变异，其中一个家庭中有两个患有神经退行性病变和小脑萎缩的兄弟姐妹。PMPCB编码必需线粒体加工蛋白酶 (MPP)的催化亚基，这是大多数线粒体前体蛋白成熟所需要的。从两个成纤维细胞系中分离出的线粒体和来自一个患病个体的诱导多能干细胞及其分化的神经上皮干细胞中均显示出PMPCB水平降低和加工中间体frataxin的积累，frataxin是MPP功能障碍的敏感底物。将鉴定出的 PMPCB 变种引入同源的酿酒酵母 Mas1蛋白中，会引发严重的生长缺陷和 MPP 加工缺陷，导致线粒体前体蛋白的积累和Fe-S簇早期的生物合成受损，而Fe-S簇对多种重要的细胞功能是不可或缺的。对患者活检材料的分析揭示了含Fe-S簇的呼吸链复合物的活性改变和降低以及线粒体和胞质Fe-S簇依赖酶的功能障碍。我们的结论是，PMPCB的双等位基因突变导致MPP蛋白的降解活性降低，进而引发Fe-S簇生物合成障碍和儿童早期神经病变的复杂神经表型。

关键词：线粒体前体蛋白酶；线粒体靶向信号；线粒体蛋白生物发生；线粒体疾病；神经变性

引言

线粒体是细胞功能不可或缺的细胞器，其参与了许多关键的细胞过程。线粒体基因或核基因突变可导致多种线粒体疾病，这些疾病在儿童复杂神经疾病中占有很大比例，特别是具有神经退行性过程的疾病。^1-3绝大多数线粒体基因编码在核基因组中，线粒体前体蛋白在细胞质核糖体上被翻译出来后，都需要经过精细的过程才能够导入线粒体。^4-7大约70%的前体蛋白N端携带可切割的前体序列，这些前体序列作为线粒体蛋白导入的靶向信号。⁸复杂的蛋白质转运机制能识别前体序列，并帮助前体蛋白穿过线粒体膜。^4–6,9,10位于线粒体基质中的必需线粒体加工蛋白酶(essential mitochondrial processing protease, MPP)是去除这些前体序列以使成熟蛋白折叠和发挥功能的关键酶。MPP从酵母到人类高度保守，由两个亚基组成:发挥催化功能的PMPCB亚基(酵母中的Mas1)和非催化功能的PMPCA亚基(酵母中的Mas2)。PMPCB/Mas1是一种具有锌结合基序的金属蛋白酶，而PMPCA/Mas2与底物识别和结合有关。^{11 – 15}

本文中，我们共报道了4个家庭的5个携带PMPCB双等位基因变异(MIM: 603131)的个体。所有患儿均表现为发作性神经功能减退，基底神经节病变和小脑萎缩，并被怀疑患有线粒体疾病。对在其中一个患病个体中提取的人类诱导多能干细胞(hiPSCs)、神经上皮干细胞(NESs)和纤维母细胞以及酵母中的同源Mas1蛋白变异的功能研究表明，PMPCB变异严重损害线粒体前序列的处理。此外，酵母模型揭示了线粒体Fe-S簇的生物合成存在显著缺陷，而Fe-S簇对线粒体生物能量过程、核基因组维护和细胞质蛋白翻译等许多细胞功能都是不可或缺的。对患者活检材料的分析发现，呼吸链复合物的形成发生了变化并且活性降低，其中包含几个Fe-S簇以及线粒体和细胞质中含有乌头酸酶的Fe-S簇功能紊乱。我们将PMPCB的致病突变确定为一种线粒体疾病的新机制，该机制能够在儿童早期引发小脑萎缩的leigh样表型。

对象和方法

对象评估

参与本研究的知情同意书已从所有同意《赫尔辛基宣言》的父母那里获得。所有研究都是在当地机构审查委员会(IRB)的批准下完成的。所有的家庭都对纳入研究的临床资料进行了详细的回顾。

A家庭在美国Aurora Colorado儿童医院线粒体诊所进行评估，并同意IRB批准的研究(COMIRB 07-0386和16-0146)。B家庭在美国得克萨斯州沃斯堡库克儿童医生网络的遗传学部门进行评估，并通过费城儿童医院的一项研究协议登记。C家庭在维多利亚临床遗传学服务、默多克儿童研究所进行了评估，该研究得到了澳大利亚墨尔本皇家儿童医院和日本横滨市大学医学院当地机构伦理委员会的批准。在德国基尔大学神经儿科系开展的罕见癫痫综合征EuroEPINOMICS项目和德国研究基金会的德国-以色列-巴勒斯坦三边项目中，对D家庭进行了评估。EuroEPINOMICS研究和三方项目(A 115/02, A 116/02)以及在石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医院综合精神病中心(Zentrum fuuml;r Integrative psychiatry)进行的hiPSCs获取方案已获得基尔大学当地机构审查委员会的批准(A 145/11)。GeneMatcher工具用于搜索和识别其他具有PMPCB变异的疑似诊断的个体。¹⁶

基因分析

A家庭

威斯康星州医学院(Milwaukee, WI)进行了基于Trio的全外显子组测序(WES)。靶向富集使用安捷伦全外显子试剂盒，v.4。根据制造商的协议，在Illumina HiSeq 2500上进行测序。利用Burrows-Wheeler Aligner (BW A)将读书定位到参考人类基因组(GRCh37/hg19)。¹⁷使用SAMtools¹⁸识别变异体，并使用SeattleSeq进一步注释。使用Galaxy对遗传模型进行筛选和测试。¹⁹利用dbSNP构建的137,1000个基因组(2010年11月23日发布版本)、Exome Variant Server (EVS, ESP6500SI-V2)和Exome Aggregation Consortium ExAC浏览器(v.0.3)筛选变异体。利用dbSNP137，发现了等位基因频率小于1%的罕见变异。然后使用来自该家族的序列数据来测试不同遗传模型下的因果变异。PMPCB变异体通过Sanger测序进行验证。

B家庭

如上文所述，基于Trio的WES由一家商业实验室(Ambry Genetics)进行。^20,21简单来说，样品用IDT xGen Exome Research Panel V1.0 (IDT)制备，并在Illumina HiSeq 2500平台(Illumina)上采用双末端、100个循环的化学方法进行测序。序列与GRCh37/hg19对比，使用CASAVA和Pindel进行变异识别。在去除常见的单核苷酸多态性(SNP)、基因间和3/5 UTR变异、非剪接相关的内含子变异和同义变异后，剩余的变异被筛选为新生显性、纯合和复合杂合隐性遗传模型。除PMPCB的变异外，在该家族中没有发现其他致病或可能致病的变异。

C家庭

基于Trio的WES使用同上文一样。^22,23简单来说，基因组分区使用SureSelect Human All Exon V5(针对受影响的个体)或V6(针对父母)(安捷伦技术)进行。所准备的库在HiSeq 2000/2500 (Illumina)上运行。序列通过NovoAlign与GRCh37/hg19进行比对。在Picard工具进行PCR扩增后，通过基因组分析工具包和ANNOVAR进行变异识别和注释。²⁴根据常染色体或X染色体显性遗传(新生)和常染色体隐性遗传模型，标记候选变异。候选变异通过基于trio的Sanger测序进行验证。

D家庭

WES分别对个体D:II-1、有既往报告的其父母²⁵和患病的兄弟(D:II-2)进行。WES是在Wellcome Trust Sanger 研究所 (Hinxton, cambridge hire)作为EuroEPINOMICS RES项目的一部分进行的，按照制造商的说明使用Illumina TruSeq DNA样品制备试剂盒、安捷伦科技sureelect Human All Exon 50Mb试剂盒和Illumina HiSeq2000。个体D:II-2的测序在基尔大学使用TruSeq DNA样品制备试剂盒和Illumina HiSeq2000进行。使用Burrows-Wheeler比对器将所有通过质量过滤的样品测序读数与GRCh37/hg19人类参考基因组比对，使用Picard对重复读数进行标记。使用GATK 3.7单倍型识别器执行变异识别，使用ANNOVAR对VCF文件进行注释。²⁴使用定制工具来识别各种遗传模型下潜在的致病变异。除了两个兄弟中纯合的PMPCB突变体外，在各种遗传模型下没有发现更多的候选基因。通过Sanger测序确认PMPCB突变体。

结构建模

将患病个体中鉴定的 PMPCB 突变体建模为酵母 MPP 的晶体结构，与细胞色素C氧化酶 IV 前序列肽 ¹¹ (PDB: 1hr8) 复合。通过使用Coot.26软件，将硅烷和侧链的突变引入到首选的旋转构象中，同时最大限度地减少空间重叠并优化氢键能力。²⁶使用 The PyMOL Molecular Graphics System, v1.8 Schrouml;dinger, LLC 制作图像。

hiPSC的产生和细胞培养

人真皮成纤维细胞(HDF)取自个体D:II-2及其双亲，采用3mm穿孔机活检。活检材料被分割成更小的碎片，固定在组织培养处理过的塑料培养皿上，并保存在含有DMEM Glutamax，1%青霉素/链霉素和20%胎牛血清(FCS)的HDF培养基中，温度为37℃

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 17 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[597890]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word