使用单细胞滴基微流体形成的微生物诱导碳酸钙沉淀物的矿物学外文翻译资料

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使用单细胞滴基微流体形成的微生物诱导碳酸钙沉淀物的矿物学

微生物-矿物之间的相互作用是普遍存在的，可以促进主要的生物地球化学反应，从而驱动岩石形成等地球动力学过程。一个例子是微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)，其中微生物活动导致碳酸钙沉淀的形成。大多数MICP研究都是在中尺度进行的，但关于细胞包被和矿物多态性的机制仍然存在基本问题。本研究中，我们首次对MICP在25 mu; m直径滴中的单个溶尿大肠杆菌MJK2细胞形成的微尺度上的沉淀进行了研究和表征。随着时间的推移观察到矿物沉淀，在水合条件下观察到细胞被碳酸钙沉淀包围。用拉曼光谱分析，在滴状液中首先观察到无定形碳酸钙(ACC)，然后形成vaterite。ACC和vaterite保持稳定长达4天，可能是由于有机物的存在。当用电子显微镜观察时，vaterite沉淀表现出致密的内部结构和颗粒状的外部结构。观察到这些沉淀的自发荧光可能指示方解石相的发展。该方法为进一步研究细菌的沉淀成核、微生物-矿物相互作用和多晶转变等基本过程提供了一条途径。

微生物和矿物之间的相互作用是地质微生物学的一个中心方面，其中许多相互作用具有相互作用的结果。矿物的形成和溶解可以影响微生物的过程，如营养物质的获取、能量代生物膜结构；反过来，微生物作用可以影响矿物的形成、转化和溶解．自然界中许多地质微生物过程涉及细菌与矿物的相互作用，如重金属迁移率污染物的可利用性和沉积物磁化．微生物-矿物相互作用(MMI)在岩石的形成和风化过程中起着重要的作用酸性矿井排水以及热液喷口的形成．虽然地质微生物学过程可以很容易地在宏观尺度上观察到，但它们是由发生在微观甚至纳米尺度上的细胞和酶反应驱动的．在单细胞水平(微到纳米尺度)研究微生物与矿物的相互作用可以为深入了解大规模过程背后的潜在机制提供帮助．

MMI的一个例子是微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)，这是一种生物矿化过程，发生在自然界和工程系统中，是细菌活性的结果．当代谢过程(如硫酸盐或硝酸盐还原、尿素水解或光合作用)导致pH值和碱度增加，提高碳酸钙(- CaCO)的饱和状态时，可以发生MICP3)引起C - aCO3 降水9．式(1)总结了脲酶对尿素的水解作用。在中性pH条件下，生成的氨作为Broslash;nsted-Lowry碱，形成铵离子和羟基离子，提高pH值(公式2)。pH值的增加导致碳酸氢盐离子的增加(公式3)，增加饱和度，促进碳酸钙沉淀(公式4)。导致每摩尔尿素水解生成两摩尔铵和一摩尔碳酸钙沉淀。

MMI的可视化通常是在从台式反应器系统中提取的样品上进行的，这可能不是微生物或矿物原始状态的准确表示。这种“非原位”可视化不允许从单个细胞或小细胞群开始对微生物和矿物进行非破坏性的、时间分辨的观察。在纳米和微尺度上对MICP的非侵入性可视化具有提供矿物成核、矿物生长和矿物类型的时间分辨和定量比较的潜力。这些比较对于理解MMI和将发生在纳米和微米尺度的生物地球化学反应与宏观尺度联系起来是很重要的。MICP过程中发生的一种微生物-矿物质相互作用是-CaCO包裹溶尿细胞沉淀冲击波在大量的MICP实验中，观察到沉淀形成后溶尿活性的下降，通常归因于细胞e囊化。虽然整体化学变化可以很好地指示细胞活性，但与封装直接相关可能不准确。最近，Zhang等人认为细胞表面的成核可能是一个过于简化的模型，并呼吁直接观察成核过程。在生物沉淀过程中细胞包埋已被一些作者提出但主要是从非原位样品的电子显微图推断出来的。电子显微照片通常显示与溶尿细胞尺寸相匹配的沉淀，或与细菌细胞直径近似的空心管状结构，这导致了细胞被埋葬在沉淀中这一假设。然而，用于电子显微镜的样品制备往往会导致样品的物理结构发生相当大的变化。在样品制备和电子显微镜观察过程中，脱水会导致样品收缩、扭曲，并可能产生其他可能不代表原始状态的伪影。因此，MICP在微尺度上的实时原位可视化需要研究细胞封装和其他MMIs的潜力。

在生物钙沉淀过程中，单细胞水平的MMIs的无创可视化可以通过液滴微流体技术实现。单个细胞可以在直径为几十微米的皮公升大小的液滴中分离出来;这些液滴是由水相和油相的流动液体以每秒数千的速度形成的，进入一个流动聚焦微流体装置，在油-油中产生水滴。当细菌细胞在d-rops中被分离时，液滴作为微观生物反应器，允许研究微生物生长，动力学，基本细胞生理学和酶动力学．基于液滴的微流体已被用于观察非生物沉淀过程但据我们所知，从未被用于从单个细菌细胞开始研究MICP。基于液滴的微流体技术可以在纳米到微尺度上对生物矿化进行高分辨率和时间分辨的观察。以非侵入性的方式研究生物矿化的能力可以为大规模沉淀过程的机制提供有价值的见解，并有助于设计新型生物基材料。

在这里，我们观察了由单个大肠杆菌-MJK2介导的尿溶解驱动的MICP使用液滴微流体的电池。我们在培养基中制备含有单个MJK2细胞的25mu;m直径滴液，观察细胞和-CaCO的生长情况随着时间的推移矿物质。我们改变了钙离子浓度，发现在尿素和MJK2细胞存在的情况下，在所有浓度的液滴中都观察到碳酸钙沉淀。培养基中的高钙离子浓度降低了细胞的生长和活力。在这些实验中，在邻近的没有溶尿细胞的液滴中也观察到沉淀物，表明液滴交换促进了没有溶尿细胞的液滴的沉淀。在液滴内形成的沉淀用一系列显微镜和微分析技术进行了表征。我们观察到-CaCO的两种不同的多态性以滴状、vaterite和无定形碳酸钙(ACC)形式析出。含vaterite滴与含ACC滴的比例随时间变化，取决于钙离子和尿素浓度的初始比，在钙离子和尿素的等摩尔比时达到最大值。经聚焦离子束磨铣扫描电子显微镜(FIB-SEM)观察，以拉曼光谱鉴定为钒铁矿的析出物呈现出两种不同的形貌(致密核和颗粒状外壳)。这些沉淀也表现出自发荧光，表明可能存在方解石纳米晶体。本研究从单细胞开始研究MICP的形成，重点关注细胞生长、细胞活力和沉淀态随时间和培养基中钙离子浓度变化的差异。本文提出的方法为研究从单个细菌细胞开始的微生物-矿物过程，包括生物沉淀的形成、溶解和多态性转变提供了一个平台。

实验方法

培养基和细菌细胞培养。大肠杆菌MJK2是一株通过基因工程表达GFP并产生-脲酶的菌株，用于促进MICP。MJK2的生长培养基为Luria-Bertani培养基(BD Difco, Fisher Scientific, NH, USA)， 10 mu;g mL修正庆大霉素，50 mM l -阿拉伯糖和10mu;M氯化镍(Sigma-Aldrich, MO, USA)．将50 mu;L的MJK2冷冻砧木加入到10 mL的培养基中，置于50 mL用铝箔松散覆盖的离心管中，制备细胞培养物。将离心管竖直放置在室温(24.5plusmn;1.5°C)下150rpm的水平振动筛上。24 h后，用BIOTEK Synergy HT分光光度计测量光密度(600 nm波长，200 mu;L样品在96孔板上，空白孔OD值为0.044)，调整到OD值为0.4使用培养基。为了使每10滴中有1滴显示出单个细胞，需要进行额外的稀释。通过一系列细胞计数实验(参见补充资料和补充图S1)，确定1:5稀释是最优的。

将尿素和二水氯化钙(Fisher Scientific, NH, USA)按表1所示浓度添加到生长培养基中，制备本研究中所测试的六种条件的培养基。三个条件——(CaLow, caInt 和caHigh)具有MICP发生的前提条件(溶解钙、溶解尿素和MJK2，参见方程1-5);其他三种条件为阴性对照实验(在表1中用“*”标记)，或培养基中不含钙(Ca2 培养基中不含尿素(无尿素)或不含细菌(无细菌)。使用Nalgene Rapid-Flow 0.45micro;m孔径的瓶顶过滤器(ThermoFisher Scientific, MA, USA)对所有培养基进行过滤灭菌。生成液滴时培养基pH值为6-6.3，保证实验前无非生物沉淀。

生产和工作流程。由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的共流微流控器件采用标准软光刻技术在内部制作．将1:5稀释的细菌培养液、培养基和Novec HFE-7500氟碳油(3m，美国St. Paul, MN, USA)与1.5% (w/w) 008-氟表面活性剂(RAN Biotechnologies)一起流动，产生直径为25micro;m的滴液。在一个流动聚焦的共流微流体装置中。细菌培养液加新鲜培养基形成了油包水乳状液的内相，含油表面活性剂形成了外相。使用校准的注射器泵，设置细菌培养液和培养基的流速为200micro;L hminus;1 油的流速为800micro;L hminus;1．将液滴收集在1.5 mL的微离心机管中，并保存在室温下，用于接下来的4天的实验。

批量实验。进行了批量实验，比较细胞在不同钙离子浓度下的液滴生长和更大体积的细胞生长以及尿溶解。批量实验使用10ml培养基，设计添加细菌接种物的体积来模拟液滴生成时的细胞-培养基比例。大量实验在50毫升离心管中进行，离心管松散地覆盖铝箔，并在水平振动筛上垂直培养(150 RPM)

温度。使用BIOTEK Synergy HT分光光度计对200份micro;L样品进行荧光测量(激发485plusmn;20 nm，发射528plusmn;20 nm)，取样时间与滴入成像时间一致(参考空白孔荧光读数为88个荧光单位)。样品也用5%的硝酸稀释(Fisher Scientific, NH, USA)，用于使用比色容格分析法测定尿素浓度．使用Symphony SB70P pH计(VWR, PA, USA)测量样品pH值。

显微镜和显微分析。时间分辨分析。从液滴产生时间(第0天)到实验结束96 h(第4天)，每隔24 h对液滴进行一次成像，除无菌对照组在第0天和第7天进行图像外，所有实验共5个时间点对液滴进行一次成像。在所有的实验中，有足够大的液滴填充DropSOAC微流控装置从微离心管中取出，在室温下使用倒置共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，徕卡SP5)进行成像。在成像过程中，将浸透水化油的DropSOAC装置浸入水化油中，以最大限度地提高下降稳定性．在DropSOAC装置中，使用20 times;空气目标和以下照明通道，从随机选择的位置对水滴进行成像:

(i)整个液滴的Brightfield图像(透射图像)，增益168，针孔60micro;m

(ii) GFP(激发:488 nm激光，发射:490 - 590nm)检测MJK2细胞，612增益，200 mu; m针孔(iii) UV(激发:405 nm激光，发射:415 nm - 550 nm)通过方解石的-自体荧光检测， 600增益和200micro;m针孔

(4)反射光(488 nm入射激光，检测在478 nm - 498 nm之间)检测出沉淀(未激发荧光团)，200 mu; m增益，60 mu; m针孔。反射信号可以显示当入射激光反射固体材料时产生的沉淀物。

的caco3 荧光被称为“自体荧光”，因为它不需要添加荧光团来产生信号。每个通道CLSM的图像采集参数(增益和针孔孔径)在实验间保持一致，用于不同实验的0.4 od调整培养物的初始荧光具有可比性(相对标准偏差lt; 2%)。采用200 mu;m针孔孔径拍摄的单面图像从较大的成像体积捕获信号。这种方法从失焦平面捕获信号，允许对整个下降进行快速成像，同时防止在Z-stack采集期间出现在多个平面的运动细胞的信号高估。含有细胞的滴被检测使用ImageJ TrackMate插件31 以25 mu;m为液滴检测直径，以GFP通道图像上的GFP信号为中心(与相应的亮场图像对照)，测量每个液滴的荧光强度。补充表S1提供了每次测量分析的液滴数量。对于运动测量，一个30秒的采集视频从每个实验大约300滴分析细胞游动速度的平均轨迹速度(mu;m sminus;1使用TrackMate)。基于GFP信号检测限制在5micro;m直径的细胞滴中检测出磁道(磁道数量见补充表S2)。细胞链(第1天和第2天的C - aInt)，直径约束设为10micro;m。基于trackmate的水滴检测以反射通道图像的信号为中心，对含有沉淀的水滴进行计数。用于检测的不同直径设置用于区分含有两种观察到的沉淀形态的液滴(详细信息见补充信息)。

沉淀特征。第4天，从液滴中收集沉淀物，用于显示和测定元素组成和沉淀物矿物学。取10mu;L的液滴样品在室温下在玻片上风干过夜，将液滴乳化破碎，暴露出沉淀。干燥的样品转移到金属短节上的粘碳带上，在20 mA下溅射镀上铱1分钟，使用蔡司SUPRA 55VP场发射扫描电子显微镜(SEM)进行成像。使用能量色散x射线能谱(EDX)对同一样品进行分析，以表征沉淀的元素组成(Scanning Auger Electron Nanoprobe, Nano-Auger, Physical Electronics 710)。此外，利用拉曼显微光谱(Horiba LabRAM HR Evolution NIR)对每个矿化实验的风干沉淀进行了分析。样品也使用聚焦离子束扫描电子显微镜(FEI Helios Nanolab双束FIB-SEM)和高分辨率扫描透射电子显微镜(像差校正Titan 80-300 STEM)进行分析。FIB-SEM样品是将风干后的样品放置在金属扫描电镜上，并在表面涂上碳制成的。在TEM中，在风干的液滴样品中加入无菌水，将沉淀悬浮液转移到带花纹的碳栅格中，然后风干。

结果与讨论

我们观察到MICP从大肠杆菌MJK2的25 mu; m直径的单个细胞开始，在不同浓度的钙离子下，MICP下降(图2)。细胞进行尿溶解，导致碱度增加，随后沉淀-CaCO3 根据方程式中概述的反应方案。三个对照实验，无尿素，-Ca2 结果表明，在所有矿化实验中，液滴内部形成的沉淀均为溶尿MICP的结果。图2中的“Overlay”列显示了亮场、GFP和UV信号的叠加，“Refl”列显示了对应的反射信号图像。MJK2细胞发出的绿色GFP信号随着时间的推移而增加(参见图3a的定量分析)，一些沉淀物在第2天开始在-Ca中发出红色的自发荧光信号Low, caInt, caHigh 下降。

细胞的生长、聚集和运动。从每滴GFP强度的增加可以明显看出，细菌在滴中生长(图2、图3a)。GFP信号随时间下降的趋势与除-Ca外所有条件下相应的整体GFP测量值相似Int (补充无花果。S3和S4)。在C -

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