丙型肝炎病毒核心抗原表位的细菌细胞表面展示技术外文翻译资料

丙型肝炎病毒核心抗原表位的细菌细胞表面展示技术

原文作者 Su-Min Kang a, Jin-Kyu Rhee a, Eui-Joong Kim b, Kwang-Hyub Han c,Jong-Won Oh a;m

单位 a Department of Biotechnology, Yonsei University, 134 Sinchon-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-749, South Korea

b Genofocus Inc., 461-6 Jeongmin-dong, Yusung-gu, Daejeon 305-811, South Korea

c Department of Internal Medicine, Institute of Gastroenterology, College of Medicine, Yonsei University, C.P.O. Box 8044, Seoul 120-752, South Korea

摘要：蛋白的细胞表面展示技术已经被广泛应用于展示酶和抗原。文章里我们展示了有一个内重复的域(INC)的删除的假单胞菌的冰核蛋白，它可以在大肠杆菌中被使用，通过融合到INC的c末端，以构象活性的形式显示肽在折叠蛋白的外部。诊断潜在的技术证明了有效的抗原决定映射来自丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白。通过对丙肝病毒(HCV)核心蛋白的抗原表位的有效映射，证明了该技术的诊断潜力。丙肝病毒核心蛋白的氨基酸1-38和26-53被发现与商业诊断相比，在与HCV患者血清的原生构象中反应更敏感,c22p display-ELISA(氨基酸10 -53)。这些结果表明，细菌细胞表面显示技术对肽表达和抗原的表位定位有用。

关键词： 细菌细胞表面展示； 冰核蛋白； 肽展示； 丙型肝炎病毒核心蛋白； 表位定位；诊断。

1. 简介：

在活菌细胞上的异种蛋白的表面显示已被用作快速筛选配体和抗原或酶表达的有力工具。不同的外膜蛋白比如LamB ^[1], PhoE ^[2], OmpA ^[3], TraT ^[4], OprI ^[5], OprF ^[6], FHA^[7],和INP^[8]作为表面展示的锚定主题。超冷水中加速冰晶形成的INP、冰核蛋白是一种假单胞菌的外膜蛋白^[9]。与冰核过程有关的INP蛋白质由约3.5 kb的inaK基因编码，含有122个重复域，由基本的八肽组成^[10]。INP 和INC可以通过删除重复域减少重组锚定蛋白的大小，可以作为异种蛋白展示在细菌细胞表面 ^[11-14]。

丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒，常导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的持续感染^[15]。长约9.5 kb的RNA基因组编码了3011个氨基酸残基的一种多蛋白质，由细胞和病毒蛋白酶处理，形成结构和非结构蛋白^[16]。氨基末端的蛋白质(氨基酸1 - 191)处理丙肝病毒多蛋白的细胞生成成熟的丙肝病毒核心蛋白的蛋白酶^[17]。

自从HCV被发现^[15]，对HCV抗体检测的血清学检测已取得重大进展。HCV核和非结构蛋白(NS3, NS4, NS5)的抗体已被抗原蛋白检测，用于诊断丙型肝炎病毒感染^[18,19]。核心蛋白被认为是诊断的一个重要目标,因为丙肝病毒核心抗体蛋白存在于大多数慢性HCV感染的患者^[20,21],其氨基酸序列是常见的不同基因型之间^[22,23], 而抗核抗体的存在与病毒复制密切相关^[24]。因此，HCV核心蛋白的合成肽和HCV非结构蛋白的其他部分多肽已经被用于检测人血清或血浆中的HCV抗体，通过免疫印迹法 ^[25,26]。生成氨基酸2-120的核心蛋白质的C22-3，被用作第二代抗丙肝病毒测试的重要组成部分^[27]。C22肽(c22p)是HCV核心蛋白(氨基酸10-53)的主要共识表位，已被作为诊断HCV患者血清中HCV核心抗体的生物学证据^[28]。

在研究中，我们证明了在大肠杆菌细胞表面通过融合到c末端的小肽，在折叠蛋白的外面以一种构象活性形式呈现，并阐述了利用HCV核心蛋白作为模型系统来绘制抗原表位的方法的潜力。

2.材料与方法

2.1. 表面表达载体的构建

质粒pT7INPNC 表达INC ^[29]被用于HCV核心融合蛋白的表达。利用HCV基因型1b型感染患者血清中提取的总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到HCV核心蛋白的全长cDNA序列。HCV核心蛋白的全长cDNA序列通过上游引物 (5P-GATTGGGGGCGACACTCCACC-3)和下游引物(5P-GGAATTCCTTAAGCGGAGGCTGGGATGGTC-3P)，利用BamHI 和EcoRI 酶，并在质粒pT7INPNC 中加入相同的酶，最终生成pT7INC-core. 对重组质粒进行测序，以确定正确的开放阅读框。图2A中所示，部分HCV核心基因片段编码c22p和C1到C8，以pt7incl -core为模板，使用Vent DNA聚合酶(NEB) ，采用常规PCR方法。用BamHI和EcoRI酶切的扩增PCR产物被插入pT7INPNC，生成pt7 -c22p和-C1到-C8。pT7INPNC-6His质粒表达在C端带有6His标签的INC ，通过传统的克隆方法编码INC到pET-22b( )质粒载体上的。

2.2 INC融合蛋白的表达

将大肠杆菌BL21（DE3）（F3，ompT，hsdSB [r3B，m3B]，gal，dcm，[DE3]）转化体在Luria Bertani培养基（0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨， 至1％NaCl）中，37℃下补加100mu;g/ ml氨苄青霉素，直至600nm处的光密度（OD）达到V0.5，并且通过加入1mM异丙基氯化铵在25℃诱导蛋白质表达6小时 -LD-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）。

2.3免疫印迹分析

蛋白质样品在十二烷基硫酸钠浓度10%的聚丙烯酰胺凝胶上分析。这些蛋白随后被转移到硝基纤维素膜上。用含吐温20的1%牛血清白蛋白(BSA) (TBST; 20 mM Tris^HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.5)室温封闭1小时。封闭后的膜用兔抗INP 1：1000稀释比，丙肝病毒病人血清,乙型肝炎病毒病人血清,或正常血清（病人和正常血清由延世大学的胃肠病学研究所医学院的K.H.汉博士提供)孵育1小时，然后用TBST洗涤3次。然后用1:50 000稀释的兔抗山羊兔IgG或人抗IgG孵育1小时，然后用TBST冲洗3次。通过与硝基蓝四唑和5-溴-4 -3-吲哚磷酸的预混合溶液的反应，观察结合的抗体。

2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）

利用IPTG诱导的大肠杆菌，用磷酸盐缓冲液 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.3) 冲洗三次，并用PBS悬浮在200ul细胞悬液包被的600nm直径的1.0.多孔板中，37℃封闭过夜。200ul2% BSA细胞悬液25℃孵育1小时，细胞结合在多孔板上而未结合的细胞被PBS洗掉。去除封闭液后，用丙肝患者,乙型肝炎病毒的病人,或正常血清PBS 1:1000稀释，无特殊情况下，25℃孵育2小时。用PBS洗涤5次后，细胞表面的抗原抗体复合体用用1:5000稀释的碱性磷酸酶-共轭山羊抗人IgG在25℃孵育1小时。用PBS洗涤5次后用硝基苯基磷酸盐溶液作显色液。15分钟后，在405nm波长下用酶标仪测量每孔的吸光值。所有数据都采用三联的方法。总共用了HCV病毒RNA阳性患者10种不同的血清，使用不同基因型HCV和HCV基因组的滴度来进行酶联免疫吸附法展示。采用HCV线探针测定HCV基因型^[30]，并对HCV病毒RNA[31]的量化进行bDNA定量分析。

2.5免疫荧光显微镜分析

收集表达带有6His或-c22p标签的细胞，用PBS洗涤，并在PBS中被重新悬置到0.5的直径为600 nm的多孔板中，包含3% BSA和1:50稀释的6His标签的单克隆抗体抗体或1:100稀释的HCV患者血清。4℃孵育过夜后，抗原抗体复合体被显示到细胞表面，用PBS冲洗5次后，用鼠抗山羊或人抗IgG（包含3% BSA的PBS1:100稀释）37℃孵育2小时。PBS冲洗5次后，使用共聚焦激光显微镜观察FITC的存在。

2.6流式细胞仪检测分析

富集转化的大肠杆菌((0.4times;109)的培养物并用含有0.5％BSA的PBS（PBSB）洗涤三次。然后让细胞在用PBS 1：1000稀释的HCV患者血清在PBSB中在4℃反应30分钟并用PBSB洗涤三次。展示在细胞表面上的抗体抗原复合物与1：3000稀释的FITC缀合的山羊抗人IgG在4℃孵育30分钟。用PBSB洗涤三次后，使用FACScan流式细胞仪根据荧光强度分析分析500ulPBS中的样品。收集表达全长HCV核心蛋白，C2或C3的重组大肠杆菌细胞的数据

3结果

3.1使用INP的小肽的细胞表面展示

尚未表征INP或INC的C-末端尾部是否功能性地以配体展示在蛋白质表面上，例如包括抗体的蛋白质，进行有效的相互作用。因此，我们首先测试了融合到INC [INC（His）6]的C-末端的六个组氨酸残基是否正确地定位在INC分子上，并通过对转化的细菌细胞进行免疫荧光染色而显示在大肠杆菌细胞表面上 并通过使用带有（His）6标签的抗体的酶联免疫吸附展示法进行。图1A中显示的结果表明INC的C末端的组氨酸残基以功能活性形式显示在蛋白质的外部以被带有（His）6标签的单克隆抗体识别。使用在微量滴定板上展示INC-（His）6的完整大肠杆菌细胞的展示酶联免疫吸附法也显示对抗（His）6抗体的阳性反应（数据未显示）。使用在微量滴定板上展示INC-（His）6的完整大肠杆菌细胞的酶联免疫吸附展示抗（His）6抗体的阳性反应（数据未显示）。

接下来，我们研究了使用融合到INC的C-末端的HCV核心蛋白表位c22p（氨基酸10-53）的肽展示系统的诊断潜力。观察到在细胞表面上表达c22p的完整大肠杆菌细胞通过免疫荧光显微镜检查对HCV患者血清进行强化染色（图1A，右下图），而在显示INC的大肠杆菌细胞中未检测到染色（图1A，左下图），表明标记有c22p肽INC的尾部可以被血清中的抗HCV核心蛋白抗体所接触。同样地，在INC的C-末端的（His）6标签被抗（His）6抗体识别（图1A，右上图）。这些结果表明INC的C末端尾部显示在蛋白质表面上，用于与抗体有效的相互作用。

使用探针对INP和HCV感染的患者血清的抗体对来自转化细胞的裂解物进行的蛋白质印迹分析检测了约44kDa的INC-c22p融合蛋白的表达（图1B）和其特异性检测抗HCV核心蛋白 抗体（图1C）。 通过用抗INP抗体和抗（His）6抗体的蛋白质印迹分析也证实INC和INC（His）6的表达（数据未显示）。

3.2 HCV核心蛋白的线性抗原表位的图谱

由于与INC的C末端融合的肽充分存在于INC蛋白质的表面，因此我们想要调查这种细胞表面展示系统是否可以进一步应用于使用HCV核心蛋白作为抗原来映射抗原的线性和构象表位模型系统。首先，使用共表达为INC融合蛋白的8种HCV核心蛋白肽（C1至C8）鉴定线性表位（图2A）。这些融合蛋白的表达水平都与用抗INP抗体的蛋白质印迹分析相似（图2B）。但是，它们在HCV患者血清中与抗HCV核心抗体反应不同，表明HCV核心肽各区域具有不同的抗原特异性（图2C）。

HCV感染的患者血清中具有C2，C3，C6和C7，但是C4，C5和C8弱的抗HCV核心抗体的强免疫反应性清楚地表明38个氨基酸的N-末端区域是主要的线性表位。从C7中删除这些前38个氨基酸可显著地消除与抗体的反应性（图2C，比较C7与C5）。包含氨基酸53-55（与C1比较）和肽C4（氨基酸101-121）的肽C5和C8被血清微弱地识别。这些数据表明主要抗原表位在氨基酸1-38内，但弱线性表位也存在于氨基酸53-75和101-121内。

3.3用于检测患者血清中抗核心蛋白抗体的酶联免疫吸附展示法

为了测试天然构象中HCV核心蛋白的免疫反应性，进行了展示酶联免疫吸附法。将微量滴定板孔用显示INC本身或INC核心肽融合蛋白的大肠杆菌细胞包被。显示-ELISA显示来自显示INC的细胞的弱信号，而从涂覆有显示C2，C3，C6和C7的细胞的孔获得更高的OD值（图3）。在跨越氨基酸26-38的区域中与C2重叠的C2肽（氨基酸26-53）和C3肽（氨基酸1-38）被证明是在展示酶联免疫吸附法中由抗核心蛋白抗体识别的必需表位这与图2C所示的结果一致

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