一种来自盐生植物Atriplex Canescens(Pursh)Nutt.的重金属分离蛋白质(AcHMA1)，在酿酒酵母中表达对铁和其他非生物胁迫的耐受性外文翻译资料

一种来自盐生植物Atriplex Canescens(Pursh)Nutt.的重金属分离蛋白质(AcHMA1)，在酿酒酵母中表达对铁和其他非生物胁迫的耐受性

• 摘要：许多重金属对代谢过程来说是必不可少的，但在较高的水平上是有毒的。 金属耐受蛋白具有对这种毒性的抗性。在本研究中，我们从盐生植物，四翅滨藜，中鉴定并表征了一种重金属相关蛋白AcHMA1。 序列分析表明，AcHMA1含有两个重金属结合域。 金属(Fe、Cu、Ni、Cd或Pb)、PEG6000和NaHCO3处理可诱导AcHMA1的在四翅滨藜中表达，而NaCl和低温会降低其表达。AcHMA1在金属胁迫耐受中所起的作用通过使用酵母表达系统得到了测试。AcHMA1基因的表达，显著提高酵母细胞的能力去适应和从暴露在多余的铁中恢复过来。在精母细胞中，AcHMA1的表达还提供了耐盐、碱性、渗透和氧化剂的胁迫能力。最后，烟草细胞中AcHMA1/GFP融合蛋白的亚细胞定位显示AcHMA1定位在质膜上。 因此，我们的结果表明AcHMA1编码膜定位金属耐受性蛋白，介导真核生物对铁的解毒。此外，AcHMA1也参与对非生物胁迫的回应。

关键词：HMA（重金属相关）结构域；亚三聚体；铁耐受性；非生物胁迫；酵母表达

导言

许多重金属，包括铜(Cu)、铁(Fe)、锰(Mn)、镍(Ni)和锌(Zn)，是多种植物生理过程所需的必需微量营养素[1,2]。例如，铜作为酶催化的辅助因子，在真核生物的细胞呼吸、抗氧化防御和铁代谢的生物化学中起作用[3]。从呼吸到光合作用，维持生命的过程需要铁。然而，过量的重金属是有毒的。它们可以通过阻断必需的官能团或取代其他金属离子种类来灭活生物分子[4]。此外，Cu、Fe和其他金属可以参与产生反应自由基、超氧化物和过氧化氢的反应。 自由基与水反应生成羟基自由基，可损伤细胞成分，如DNA、蛋白质、脂质和糖[5,6]。 为了维持金属的稳态，植物进化了不同的机制来调节金属离子的浓度，以及通过控制它们的吸收、挤压、螯合、分布、储存和固存来排除非必需的形式[7]。

在微生物、哺乳动物和植物中运输重金属的蛋白质在其序列和结构上在王国之间有着相似之处。相同的重金属相关结构域(HMA，pfam00403.6)是重金属转运蛋白和解毒蛋白的特征。HMA具有拥有两个保守的半胱氨酸残基的核心氨基酸序列基序M/L/IxCxxC，参与重金属结合[8,9]。一些来自动物、酵母、细菌和植物物种的HMA结构域蛋白专门结合铜，并参与铜稳态[8,10]。HMA结构域也表现出与其他重金属的结合活性，如镍或锌[9,11]。汞离子的细菌载体MerP能分离Hg² 周质空间中的离子[12]。对来自各种不同生物体的几种含HMA的蛋白质的分析表明，它们在重金属转运和稳态中起着至关重要的作用[11,13]。

酿酒酵母是研究基本细胞过程的模式生物，包括矿物营养物质和微量元素的摄取、代谢和稳态控制[14]。瑞格和他的同事使用酵母系统来鉴定金属对人p53的致突变作用，并评估真核生物中的一般重金属毒性[15]。此外，酵母是研究抗逆性机制的优良生物[16-19]。酵母中GhBCP1和GhBCP4的表达显著提高了在Cu² ，Zn2 以及高盐度胁迫下的细胞生长速率 [20].

四翅滨藜是一种盐生植物，对盐度、干旱、重金属和温度具有较高的耐受性。四翅滨藜是一种旱生植物，自然存在于沙漠中，用于干旱区恢复项目[21]。在此之前，为了更好地理解A.canescens的抗逆性机制，从叶片和根组织中获取了一个全长的cDNA文库，该文库依赖于400 mM NaCl。该基因文库提供了343个高质量的表达序列标签(ESTs)[22]。在此，从cDNA文库中分离出含有蛋白AcHMA1的HMA结构域的基因。采用定量实时RT-PCR技术揭示了

不同非生物胁迫下AcHMA1的表达模式。为了阐明其作用，我们研究了AcHMA1转基因酵母对Cu2 ，Fe2 ，Fe3 ，Zn2 ，Pb2 ，Cd2 ，Ni2 ，Mn2 和Co2 的耐受性。这种含有AcHMA1的转基因酵母也被用来深入了解AcHMA1在盐、碱性、渗透和氧化剂胁迫中的作用。通过瞬时表达在Nicotiana benthamiana Domin中的AcHMA1-GFP融合蛋白研究了AcHMA1的亚细胞定位分析。

1. 结果和讨论

序列表征和演绎氨基酸序列比较

从A. canescens的cDNA文库中克隆了AcHMA1(KF863910)基因的1270-bp全长cDNA拷贝。假定的ORF编码含有13.6%赖氨酸的316个氨基酸残基的多肽，预测分子质量为35.5kDa，等电点为pH8.6，并且计算的等电点为pH8.6。它包含两个重金属结合核心基序(CXXC)[23]。这些被认为是过渡金属离子的结合位点[24]。第一个位点(HMRI)开始于氨基酸38，第二个位点(HMR2)开始于氨基酸147(图1a)。

图1(a)AcHMA1与来自不同生物体的同系物之间基于结构的序列比对。所显示的蛋白质来自P.persica、A.thaliana、V.vinifera和A.canescens；黑色背景表示保守残基；棕色背景表示被鉴定为80%以上保守的残基。保守的重金属相关结构域由黑色框架(HMRI)和红色框架(HMR2)标记；对金属离子结合和转移重要的关键残基（两个半胱氨酸残基）由三角形标记；(b)与来自A.thaliana含有CXXC（重金属结合核心基序）结构域的蛋白质对齐。预测的AcHMA1蛋白含有两个CXXC基序，第一个基序开始于氨基酸47，第二个基序开始于氨基酸155。法呢基化蛋白3(ATFP3)；铜转运蛋白(AtATX1)；铜转运蛋白(AtCCH)；铁氧还蛋白(AtFDX1)；(c)预测AcHMA1蛋白的三维结构模型。AcHMA1蛋白的模型是由Phyre服务器创建的。螺旋、链和线圈分别是青色、紫色和蓝紫色。假定的金属结合位点以红色突出显示。

a

268

246

311

316

图1.Cont。

b c

我们利用BLASTP分析寻找AcHMA1同源物。AcHMA1被发现类似于葡萄树的一种假设蛋白(图1a)。 在涉及重金属稳态的蛋白质中寻找CXXC金属结合结构域的同源物和对这些蛋白质的系统发育分析表明，除了关键的半胱氨酸残基外，这些蛋白质的氨基酸序列不保守(图S1)。在来自于拟南芥与重金属稳态有关的蛋白质中发现了CXXC金属结合结构域，包括法呢基化蛋白3、两种铜转运蛋白和铁氧还蛋白。这些结构域的氨基酸序列不保守，除了关键的半胱氨酸残基(图1b)。 这两个重金属结合区域被发现具有铁氧还蛋白样alpha;beta;alpha;beta;beta;alpha;beta;二次结构，这也是从AcHMA1蛋白的三维结构预测的(图1c)。

AcHMA1表达对各种非生物胁迫的差异调节

含HMA结构域的蛋白质参与金属离子代谢，结合Cd、Hg、Ni、Pb、Fe和Cu，并可由这些金属诱导；在A. canescens中测试了金属诱导的能力。定量RT-PCR是用从三个月大的植物中提取的总RNA在不同的时间间隔内进行不同的胁迫处理，如实验部分所述。时间依赖性表达谱揭示了AcHMA1在各种金属和其他非生物胁迫下的转录调控模式（图2）。铁处理的幼苗在刺激后6h表现出AcHMA1的13倍上调，但在12h下降到0.2倍，然后在24h再次增加到1.5倍。Cu胁迫使AcHMA1的表达在6h达到最高水平，然后突然降低到诱导前水平。用Ni、Pb和Cd处理也导致AcHMA1转录水平显著升高。在暴露于Ni胁迫时，AcHMA1转录水平在前6h达到最高峰值，并将该水平维持在12h，AcHMA1表达水平相对于EF1alpha;增加50-55倍，然后降低，但仍高于诱导前水平。在Pb处理下，有两个峰：转录积累在6h诱导，在12h达到较高水平；然后，转录水平在24h下降，但在48h达到更高水平，表明反馈调整。对Cd处理反应的AcHMA1转录水平在6h达到最高水平，随后在随后的时间内缓慢降低。

图2在500micro;M Fe、400micro;M Cu,200micro;M Ni、Cd、Pb、400mM NaCl、300Mm NaCHO₃、20%PEG6000和低温处理下对AcHMA1进行定量RT-PCR验证。EF1alpha;作为内部控制。 胁迫处理中的AcHMA1的相对表达水平绘制了应力处理图就像那个相对的表达折叠未处理的播种（0小时）6，12，24和48小时。错误条：标准错误。

16 14 80

400 立 方

500 M Fe

200米镍

14 12

60

12 10

10 8

相对表达水平

相对表达水平

相对表达水平

2

2 20

0

0 6 12 24 48

时间/小时

0

0 6 12 24 48

时间/小时

0

0 6 12 24 48

时间/ 小时

18

200 MCD

12 1.2

200 M 铅

400米NaCl

10 1.0

16

8 .8

14

相对表达水平

相对表达水平

相对表达水平

6 .6

8

6 4 .4

4

2 .2

2

0

0 6 12 24 48

时间/小时

0

0 6 12 24 48

时间/小时

0.0

0 6 12 24 48

时间/小时

1.2 8 4

4 ^oc

20%peg6000

300米的NaHCO3

1.0

6 3

.8

.6 4 2

相对表达水平

相对表达水平

相对表达水平

.4

2 1

.2

0.0

0 6 12 24 48

时间/小时

0

0 6 12 24 48

时间/小时

0

0 6 12 24 48

时间/小时

在盐和冷胁迫的情况下，观察到不同的调节模式，在NaCl胁迫和冷胁迫下，AcHMA1的表达强烈下调，转录水平在所有研究点都表现出强烈的下降。对于渗透胁迫，观察到强烈的诱导， 在6小时时最大增加5.5倍，随后减少到4.3倍。与PEG6000相比，碱暴露的效果不太明显。在暴露于碱性胁迫下，AcHMA1转录水平在前6小时增加，并继续增加到12小时，在刺激后24小时达到其最高水平。所有这些结果表明，AcHMA1的表达调节是特定于每个特定的诱导剂。

过表达AcHMA1可提高酵母细胞的铁耐受性

为了表征AcHMA1表达所赋予的重金属胁迫耐受性，构建了两个酵母细胞株系。其中一个以空矢量pYES2为对照(WT)，另一个以pYES2-AcHMA1为对照。 WT和AcHMA1转自酵母细胞的生长

在基础培养基上无明显差异（图3）。虽然有效铁的含量对培养物的生长有显著的影响，但在一定水平以上，铁被发现对生长有抑制作用。然而，无论是斑点试验还是生长曲线都表明， 在过量铁(Fe2 或Fe3 )存在下，AcHMA1-转化体的存活率明显优于野生酵母。对于斑点测定，当酵母培养物被稀释到0.01的密度与30mMFe2 时(图3a)，AcHMA1-转化体生长优于WT。 此外，随着Fe² 浓度增加至40mM(图3a)，WT的生长下降至1mM时受Fe3 限制的生长水平以下(图3b)。表达AcHMA1的酵母细胞即使培养物稀释到0.0001，也能生长良好；然而，即使培养物稀释到0.001，WT也不能存活。这些结果表明，表达AcHMA1的酵母比WT更耐铁胁迫。从生长曲线上看，影响最明显(图3c，d)。为了确定AcHMA1的表达是否增加了对其他重金属的耐受性，我们在添加5mM Cu 2 或10mM Cu2 ，10mM Ni2 ，1.5mM Pb2 ，5mM Cd2 ，10mM Mn2 ，15mM Co2 和15Mm Zn2 的培养基上培养了两个酵母细胞株系。与用pYES2-AcHMA1转化的酵母细胞相比，WT的生长没有显著性差异(图S2)。

图3AcHMA1转化酵母对铁的耐受性。(a，b)用载体pYES2或AcHMA1-pYES2转化的酵母细胞在合成完全培养基滴出铀(SC-U)中生长24h，并培养其OD600 用SC-U调节至1， 0.1，0.01，0.001，0.0001，在补充过量Fe2 或者Fe3 的培养基上观察两微升稀释培养物,在含有不同浓度Fe2 或者Fe3 的培养基中，表达AcHMA1的酵母细胞和对照细胞的生长。在含2%半乳糖的培养基中，在28℃下培养酵母转化子24h，然后调整OD

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