通过农杆菌真空浸润和共培养渗透（发芽）种子使烟草脆裂病毒介导小麦和玉米的全株水平病毒诱导的基因沉默外文翻译资料

通过农杆菌真空浸润和共培养渗透（发芽）种子使烟草脆裂病毒介导小麦和玉米的全株水平病毒诱导的基因沉默

原文作者：Ju Zhang^1,2, Deshui Yu^1,2, Yi Zhang^1,2,3, Kun Liu^1,2, Kedong Xu^1,2, Fuli Zhang⁴, Jian Wang^1,2, Guangxuan Tan^1,2, Xianhui Nie^1,2,4, Qiaohua Ji^1,2,4, Lu Zhao^1,2,4 and Chengwei Li^1,2,5*

单位：¹中国周口师范大学植物遗传与分子育种重点实验室，²中国周口河南省作物分子育种和生物反应器重点实验室，³中国郑州河南农业大学农学院，⁴中国周口师范大学生命科学与农学院，⁵中国新乡河南科技学院生命科学与技术学院

摘要：烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）在双子叶植物中得到了广泛应用。在这里，我们展示了它也可以用于单子叶植物，通过使用一种新的渗透溶液（含有乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐温20）来实现小麦和玉米（发芽）种子的全株水平VIGS。利用所建立的系统，八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因被成功沉默，导致处理过的小麦和玉米叶片出现典型的光漂白症状。此外，利用该系统，抑制小麦白粉病防御反应的关键基因MLO的三个小麦同源等位基因在易感小麦中同时沉默，导致其对白粉病产生抗性。该系统具有通常具有与TRV介导的VIGS系统相关的优点（例如，高效、轻微的病毒感染症状以及在不同器官中的有效性）。然而，它还有以下进一步的优点：（发芽）种子期农杆菌渗入；更快、更方便；全株水平基因沉默；充分稳定的转化；适用于研究种子萌发和植物早期发育相关基因的功能。

关键词：TRV-VIGS，真空和共培养农杆菌渗入，全株水平基因沉默，小麦，玉米

1．引言

随着下一代测序（NGS）技术的快速发展和广泛应用，越来越多的植物基因组已被测序，包括大麦、小麦、玉米、棉花等重要作物，和番茄（Schnable等人，2009年；Brauml;utigam和Gowik，2010年；Zhou等人，2010年；Brenchley等人，2012年；Kumar等人，2012年；Liu等人，2012年；Mayer等人，2012年；Paterson等人，2012年；番茄基因组联盟，2012年；Jia等人，2013年；Ling等人，2013年）。因此，大量的新基因已经被发现，需要进行功能分析来破译相关的生物学特性并探索这些基因的潜在应用。功能分析中广泛使用的方法是使用化学或物理试剂产生突变（Kodym和Afza，2003；Belfield等人，2012；Hanafy和Mohamed，2014；Serrat等人，2014；Dhaliwal等人，2015；Li等人，2016；Zhang等人，2016），T-DNA插入（Weigel等人，2000；Alonso等人，2003），RNA干扰（RNAi）（Kusaba，2004；Mahmood-ur-Rahman等人，2008；Wang等人，2008，2013）或基因组编辑（Shan等人，2013；Wang等人，2014；Kumar和Jain，2015）。然而，这些技术通常会产生大量的突变体，需要繁琐的筛选或遗传转化程序。相比之下，病毒诱导基因沉默（VIGS）是敲除植物基因的有力工具，即：快速简便，不需要低效和繁琐的遗传转化过程，可以克服基因家族的功能冗余，避免不同遗传背景之间的基因型特异性效应，及时靶向组织特异性基因，适用于基于某些VIGS载体的大规模功能分析，此外，它是分析基因的有效系统，这些基因一旦发生突变通常会致命（Dinesh Kumar等人，2003年；Lu等人，2003年；Burch Smith等人，2004年；George等人，2010年；Ramegowda等人，2014年）。

作为一种基于转录后基因沉默（PTGS）的技术，它利用植物的天然防御系统来抵御入侵的病毒。迄今为止，许多病毒基因组已被修改为VIGS载体（Dinesh Kumar等人，2003年；Lu等人，2003年；Unver和Budak，2009年；Becker和Lange，2010年；Senthil Kumar和Mysore，2011年；Ramegowda等人，2014年）。烟草脆裂病毒（TRV）可以在整个植物中大量传播，与其他病毒相比，其感染症状更轻，因此，TRV介导的VIGS（TRV-VIGS）是基因功能分析中最常用的VIGS系统之一（Burch-Smith et al.，2004）。此外，它可以沉默多种植物中的基因，如番茄、烟草、拟南芥、玫瑰、棉花、苹果和寄生植物Striga Hermontica（Liu等人，2002a；Kirigia等人，2014；Tian等人，2014；Mustafa等人，2016）。烟草中的TRV-VIGS可以在4周内完成，据报道比其他可用的基因沉默技术更快、更容易（George等人，2012年、2015年；Senthil Kumar和Mysore，2014年）。然而，TRV-VIGS在单子叶植物中应用的报道很少，特别是在小麦和玉米中。大麦条斑花叶病毒（BSMV）介导的VIGS（BSMV-VIGS）是谷物基因功能分析的有用工具，已广泛应用于单子叶植物研究，但其高效性依赖于微注射轰击仪器或烟草的体外转录或预渗透，（孟等，2009；王等，2011，2015；袁等，2011；陈等，2015；焦等，2015；张等，2015；何等，2016）限制了其应用。除了来自雀麦花叶病毒（BMV）的VIGS载体（丁等人，2006年）和最近报道的基于黄瓜花叶病毒（CMV）株ZMBJ-CMV和狗尾草花叶病毒（FoMV）的病毒载体（刘等人，2016年；梅等人，2016年；王R.等人，2016年）之外，缺乏用于玉米的VIGS工具，然而，通过沉默八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因产生的光漂白症状是部分的，这表明玉米中的这些VIGS系统不能在全株水平上发挥作用。

普通小麦（Triticum aestivum L.）有三个密切相关的亚基因组（2n=42；AABBDD），提供了人类消耗的大约20%的热量。由于这种植物在社会和经济上的重要性，人们一直在努力确定其基因特征并修改其性状，以提高其产量、质量和/或对生物和非生物胁迫的耐受性。作为一种六倍体植物（基因组为17000兆碱基；约为水稻基因组的40倍），小麦至少有三个与其大部分基因相似的拷贝。其高倍性和重复DNA含量严重阻碍正向和反向遗传分析（Smith和Flavell，1975；Choulet等人，2010；Fitzgerald等人，2010；Brenchley等人，2012；Jia等人，2013；Ling等人，2013）。因此，能够同时瞄准一个特定拷贝或几个同源基因拷贝的技术将对研究小麦和改善其农艺性状非常有益。玉米（Zea mays L.）是人类和牲畜的另一种重要热量资源。与小麦不同，玉米具有二倍体基因组，在谷物研究中被广泛用作模式植物，因此玉米有丰富的基因组(sim;2000 Mb）和遗传学知识，以及广泛的相关资源和数据库（Schnable等人，2009年）。此外，正向和反向遗传技术已用于玉米基因功能分析，如基因过表达、RNAi和流行的基因组编辑工具CRISPR/Cas9（McGinnis等人，2007；Cho等人，2014；Liang等人，2014；Nannas和Dawe，2015；Feng等人，2016；Zhu等人，2016）。然而，这些方法需要费力、耗时、低效、稳定的遗传转化。因此，对于功能基因组分析来说，迫切需要更快、更方便、更高效的新技术。

在这里，我们报告了一种将TRV-VIGS应用于小麦、玉米和其他潜在植物的新方法，包括使用真空和与新型渗透溶液农杆菌共培养，满足快速、方便和高效全株水平基因沉默的需要。

2. 材料和方法

2.1植物材料与白粉菌

小麦品种（晓岩22号）和玉米品种（郑单958号）在温室中生长，，光周期和热循环为21℃，16小时光照（150 micro;mol.m^minus;2.s^minus;1）和19℃，8小时黑暗，平均相对湿度为55%。按照先前报告的方案（Cao等人，2011年；Wang等人，2014年），经过轻微修改，在小麦品种上保留了小麦白粉菌（Bgt）分离物E18的强毒株。京411植物，保持在相同的光周期和热循环下，但在70%的相对湿度下的生长室中。本研究中使用的生物材料可免费用于研究目的。

2.2载体构建

所使用的所有寡核苷酸引物（标记为ZJXX）均由桑根生物科技（中国上海）合成，并在补充表S1中列出。pTRV1和pTRV2 VIGS载体按照先前报告的方案构建（Liu等人，2002b）。为了构建pTRV2-SlPDS，使用PCR引物ZJ01和ZJ02从番茄cDNA中扩增出先前描述的409 bp番茄PDS cDNA片段（Liu等人，2002a）。PCR产物通过KpnI和BamHI酶切和连接克隆到KpnI-BamHI酶切的pTRV2中。为了构建pTRV2-TaMLO，使用PCR引物ZJ11和ZJ12从小麦cDNA中扩增出一个459 bp的片段，该片段来自小麦MLO-B1 cDNA的碱基210–668（Wang等人，2014）。通过EcoRI和BamHI酶切和连接将PCR产物克隆到EcoRI-BamHI切割的pTRV2中。

2.3农杆菌真空浸润和共培养

小麦品种（晓岩22号）和玉米品种（郑单958号）种子用75%乙醇浸泡1min，在含0.1%吐温20的2.5%次氯酸钠浸泡6min后，用无菌去离子水冲洗5次。灭菌后的小麦种子置于培养箱中，使之在30℃的黑暗中放置30小时，在2-3层浸有蒸馏水的滤纸上发芽。经过这种处理后，萌生的芽长约3毫米。

将使用的每种根癌农杆菌菌株的10mL培养物（见下文）在LB培养基中28℃培养过夜，在Luria–Bertani（LB）培养基中添加100 mg.L^minus;1的利福平和50 mg.L^minus;1的卡那霉素。然后，将200 micro;L的每种过夜培养物接种到含有上述抗生素的20 mL LB培养基中，并在28℃下培养，直到它们达到0.04、0.3、0.5、1.0和1.5的选定光密度（OD₆₀₀）。

在烧瓶中配制20ml的农杆菌渗透液，通过将诱导的pTRV1根癌农杆菌菌株GV3101分别与携带不同pTRV2衍生载体（pTRV2、pTRV-SlPDS、pTRV-MLO）的不同诱导根癌农杆菌菌株GV3101以1:1的比例混合，并补充乙酰丁香酮（AS）（19.62 mg.L^minus;1） ，半胱氨酸（Cys）（400 mg.L^minus;1）和吐温20（5 ml.L^minus;1)。将灭菌（发芽）小麦和玉米种子浸泡在5mL农杆菌渗透液中，置于10mL带橡胶塞的医用玻璃瓶中（图1、2和补充图S3），摇动并承受使用20 mL注射器产生的约20 kPa真空压力，时间范围为0至60 s。将所得制剂倒回烧瓶中，并在28℃、180 rpm下共培养一系列预先选择的共培养时间（补充图S3）。共培养后，用消毒水冲洗渗透（发芽）的种子，去除表面吸附的农杆菌，并在土壤中生长。

2.4总RNA提取与RT-PCR

待其生长满16天，使用TRizol溶液（Invitrogen，USA）从沉默和非沉默植物（在土壤中生长，经过上述处理）的叶片和根的三个以上独立生物学重复中提取总RNA。根据Promega的建议，使用含有2micro;g总RNA、低聚物（dT）₁₈和M-MLV逆转录酶（Promega，USA）的混合物合成第一链cDNA。然后将cDNA用作定量RT-PCR（qRT-PCR）的模板，使用基因靶区外的基因特异性引物进行沉默，并按照制造商的建议使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，Japan）和CFX96实时系统（Bio-Rad，USA）进行PCR。为了检测TaPDS、ZmPDS、TaActin和ZmActin，分别使用引物对ZJ03/ZJ04、ZJ05/ZJ06、ZJ07/ZJ08和ZJ09/ZJ10（补充表S1）。肌动蛋白（Actin）被用作内部对照。

2.5白粉病感染与显微分析

白粉病感染和显微镜分析在先前报告上（Hein等人，2005年；Shen等人，2007年）进行了一些修改。采集来自取样植物主梢的叶片，并立即将其置于含有1%（w/v）琼脂和85micro;M苯并咪唑的皮氏培养皿中。叶段在21℃，连续光照（100micro;mol.m^minus;2.s^minus;1）4小时下孵化，然后以合适的密度（接种后每平方厘米接种叶片上150个分生孢子）接种Bgt E18毒力菌株。让真菌在叶段上生长60小时，然后用1:1（v/v）乙醇/乙酸

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