人工合成群落中食细菌线虫与捕食性细菌的行为交互作用

原文作者 Nicola Mayrhofer¹, Gregory J. Velicer¹, Kaitlin A. Schaal^{1,* ,dagger;} and Marie Vasse^{1,2,* ,dagger;}

单位 ¹ Institute of Integrative Biology, ETH Zuuml;rich, Universitauml;tstrasse 16, 8092 Zuuml;rich, Switzerland; nicola.mayrhofer@usys.ethz.ch(N.M.);gregory.velicer@env.ethz.ch (G.J.V.)

² MIVEGEC （UMR 5290 CNRS, IRD, UM）, CNRS, 34394 Montpellier, France

^* Correspondence: kaitlin.schaal@env.ethz.ch (K.A.S.); contact@marievasse.eu (M.V.)

^dagger; Shared last authorship and these authors contributed equally to this work.

摘要：后生动物的理论和实验研究预示着顶级捕食者将在较低的营养水平上影响中间捕食者和猎物的行为和生态。尽管微生物群落具有重要的生态学意义，但在有关捕食性微生物的研究中，很少探讨这种行为反应和营养相互作用的多样性。在本研究中，我们尝试构建了一个三级微生物食物链，来测试捕食性线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和捕食性社会细菌（social bacteria）黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）之间的行为相互作用。该线虫和细菌与两种捕食者能够取食的基础猎物细菌——大肠杆菌（Escherichia coli）和庄氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）共同培养。我们发现，即使黄色粘球菌是唯一潜在的猎物，90%以上的秀丽隐杆线虫也无法与黄色粘球菌产生相互作用。然而，大多数线虫却能被纯种的大肠杆菌和庄氏黄杆菌所吸引。此外，黄色粘球菌改变了线虫对基础猎物的捕食行为，它能将秀丽隐杆线虫从两物种的斑块中驱逐出来。这两种斑块在没有黄色粘球菌的情况下具有吸引力，这与秀丽隐杆线虫病原体的作用类似。线虫也影响了细菌捕食者的行为：黄色粘球菌增加其捕食群集率（predatory swarming rate）来响应秀丽隐杆线虫的作用，这在一定程度上取决于基础猎物的特性（basal-prey identity）和线虫密度。我们的研究结果表明，黄色粘球菌对某些土壤线虫不具备捕食的吸引力，并且当具备其他猎物时，此现象更明显。宽泛地说，我们发现线虫和细菌捕食者相互影响彼此的捕食行为，这可能对复杂的微生物食物网中的共同进化产生影响。

关键词：微生物食物网；营养的相互作用；捕食者-猎物的相互作用；中间捕食者；社会细菌；线虫；实验群落；行为

1 引入

捕食是一种经典的生物相互作用，它能影响生态系统资源周转[1,2]、物种丰度、多样性和进化[3-8]。捕食者存在于所有生物尺度上，它涵盖不同的生物，如大白鲨和微生物。虽然人们不太熟悉，但像原生生物、线虫和细菌等小型捕食者对全球生物地球化学循环做出了必不可少的贡献[9,10]，并被认为在农业[11]和人类健康[12,13]上起关键作用。此外，在微生物群落中，捕食可能是一些主要进化转变的驱动力，包括真核细胞的起源[14-17]和多细胞生物的出现[18,19]。

连接群落成员的捕食性相互作用可以用食物网和营养网络来表示，它们显示了群落成员之间的能量流动。长期以来，食物网一直是生态学的核心概念，也是研究群落结构、成对相互作用的性质和强度以及相互作用对群落生态学各个方面的间接影响的有力工具。食物网研究通常依赖于对有机体行为的直接观察，但在研究微生物时（特别是考虑到许多微生物无法在实验室条件下培养），采取直接观察的方法十分困难甚至是不可能的。生态学家依靠计算研究、数学模型和简化微生物系统的实验来研究微生物食物网中物种间的相互作用[20]，例如通量平衡分析[21-23]、两两交互的研究以及小群落生长和死亡曲线的检验[24]。这些方法通常采用自下向上的策略，基于对群落组成的仔细调查推断群落的特性。然而，他们可能会错过高阶互动和复杂的行为反应。由于捕食性相互作用可能发生在复杂的网络中，涉及不同的伙伴，并随时间波动，这些自下而上的方法可能不足以理解微生物捕食的动态和更广泛的生态影响[25-27]。

尽管微生物具有重要的生态学意义[10]，但微生物捕食者作为一种通过控制和塑造细菌群落来影响生物多样性的媒介，直到最近才得到广泛的认识[9,28-32]。微生物捕食者使用各种各样的策略来杀死和吃掉它们的猎物，包括在猎物体内生长和分裂的Bdellovibrio bacteriovorus的周质入侵策略，以及被原生生物完全吞噬和被Streptomyces远距离杀死[33]。黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）细胞是被研究最多的黏细菌种，它们成群觅食，在攻击和食用猎物时反复改变方向[34]。由于黏细菌（Myxobacteria）捕食的猎物种类多样[35]，并能强烈影响猎物的进化[36]及它们在土壤中的丰度[37]，因此推测黏细菌能够在影响土壤群落结构和进化中发挥重要作用。

根据目前的了解，黄色粘球菌可以分泌细胞外水解酶，进而分解猎物的大分子并吸收其释放的营养[38]。有关黄色粘球菌捕食的研究已经涉及到了其分子机制[34,39,40]、生态条件的影响[35,41-43]以及与单一猎物物种的进化[36,44]。关于黄色粘球菌本身是如何暴露在捕食压力下的，以及它是如何与自己的捕食者相互作用的，我们知之甚少。天然细菌群落经常被线虫、原生动物等食细菌的微动物群捕食，这可能会影响它们的结构和组成[11,45]。在自然环境中，很可能有一些这样的食细菌生物捕食黄色粘球菌，从而使黄色粘球菌成为潜在的中间捕食者。中间捕食者是指在特定的食物网中，通过杀死和吃掉其他生物来获取营养，并面临被更大的生物捕食的生物[46]。事实上，Dahl等人[47]的研究表明，在某些情况下，捕食性线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）会取食黄色粘球菌。然而，秀丽隐杆线虫是否能通过来自野生型黄色粘球菌的营养物质实现净生长仍不确定。

目前尚不清楚微生物捕食者的群落生态效应在多大程度上反映了多细胞捕食者的影响（见Steffan等人[48]）。在大型生物中，食物链内捕食（当食物链顶级捕食者和中间捕食者同时竞争同一基础猎物时）对中间捕食者的生存和分布有直接影响。Ritchie和Johnson[50]综述了94项动物研究中顶级捕食者对中掠食者中间捕食者及其猎物的影响，并且发现平均而言，顶级捕食者种群规模增加2倍会使中间捕食者丰度减少约4倍。这种影响在微生物群落中可能同样重要。除了直接的人口统计效应外，顶级捕食者还可以对中间捕食者产生实质性的行为改变，改变它们的栖息地使用和觅食活动，从而间接影响它们的生存和生长。目前还不清楚这些群落能否显现分层的营养相互作用，如果可以，食细菌生物是否能作为顶级捕食者发挥作用。因此，微生物群落动态的研究需要更好地了解细菌猎物、细菌捕食者（潜在的中间捕食者）以及食细菌线虫和原生动物（潜在的顶级捕食者）之间直接和间接的相互作用。

在这里，我们研究了在一个人工合成群落中两种捕食者物种之间的行为互作，并研究了这种互动是如何调节食物网结构的。我们把群落设为三个营养层。预测的营养相互作用如图1所示。我们假设秀丽隐杆线虫是一种潜在的顶级捕食者，黄色粘球菌是一种潜在的中间捕食者，大肠杆菌（Escherichia coli）和庄氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）作为两种基础猎物细菌。我们首先回答以下几个问题测试细菌捕食者对线虫捕食行为的影响：（1）在没有其他猎物的情况下，黄色粘球菌是否会吸引或排斥秀丽隐杆线虫；（2）细菌细胞死亡或菌株的运动是否改变了黄色粘球菌对秀丽隐杆线虫的影响；（3）与两种基础猎物相比，黄色粘球菌作为潜在猎物对秀丽隐杆线虫的是否具有更多或更少的吸引力；（4）在一个特定的捕食区域内黄色粘球菌与一种基础猎物混合后，其对线虫的吸引力是否有所改变。然后我们提出问题：线虫是否会相互影响黄色粘球菌的行为，在基础猎物的斑块内的群集行为是由于捕食者物种之间的直接互动，还是由于线虫对基础猎物种群的影响而产生的间接效应。

2 材料与方法

2.1 细菌和线虫菌株

我们使用秀丽隐杆线虫N2菌株（CGC）作为假设的顶级捕食者，用GJV1和GJV71这两种黄色粘球菌的菌株作为假设的中间捕食者。黄色粘球菌利用两种不同的运动系统驱动群体穿过固体表面，这两种运动系统习惯上被称为“A运动系统”和“S运动系统”[51]。GJV1是DK1622[52]的一个克隆，它同时具有这两个系统的功能，它被用于之前唯一一个报道黄色粘球菌和秀丽隐杆线虫相互作用的研究中[47]。为了实现本文的目的，我们在下文中将GJV1称为S菌株，用于“群集”。GJV71是GJV1的非运动性突变体，有两个基因主要缺失，一个基因对A运动性（cglB）至关重要，一个基因对S运动性（pilA）至关重要。Velicer和Yu[53]将GJV71称为“A1 cglB”。我们在下文中称GJV71为“N株”，表示无群集现象。我们选择大肠杆菌OP50菌株（CGC, Caenorhabditis Genetic Center）[54]和庄氏黄杆菌（ATCC^reg; 17061trade;）作为基础猎物细菌，因为它们分别代表黄色粘球菌的高品质和中品质食物来源，在不同程度上促进了黄色粘球菌的群集和生长[35,43]。大肠杆菌OP50菌株是实验室秀丽隐杆线虫种群的标准食物[55]。在初步实验中，庄氏黄杆菌有时表现出一种低滑行能力的表型，这抑制了黄色粘球菌的捕食。在随后的所有实验中，庄氏黄杆菌的来源是一个冷冻保存的单个菌落，这个菌落是我们从一个正常扩散的种群中分离出来的。

2.2标准培养条件

除另有说明外，生物均在直径6cm的培养皿中培养，每个培养皿中添加了14ml 1.5%琼脂CFcc培养基（“克隆生成”的培养基[56]中添加1mM CaCl₂和0.005 mg/mL胆固醇）。

2.3 秀丽隐杆线虫的培养

根据Pires da Silva等人[57]的研究，我们将秀丽隐杆线虫在10% DMSO溶液中冷冻，并将其在含有谷氨酰胺的最小盐缓冲液（M9）中解冻。我们将线虫放置在含有大肠杆菌OP50的1.5%琼脂线虫生长培养基（NGM）培养皿中，在室温下保存，每周转移一次。在线虫用于实验之前，我们对线虫进行了同期化处理。在实验开始前7天，我们将少量接种物从一个正在增长的种群转移到含有1.5%琼脂的高生长培养基（HGM）的培养皿中[58]。在室温下培养6天后，我们用M9清洗琼脂表面，获取线虫。我们将它们在173times; g下离心1分钟，除去所有上清液最终只留下1毫升，然后加入3mL漂白液（6mL ddH2O, 6mL NaOCl(5%Cl), 2mL 1M NaOH），每2分钟离心一次，共等了6分钟。这一步溶解了成虫的身体，释放出了虫卵。然后我们将上述处理后的液体重复以下步骤洗涤4次：首先离心，然后除去上清液仅留500mu;l，再加入ddH₂O至5ml。洗涤完毕后加入3.5mL M9，将含虫卵的上清液转移到6cm的培养皿中，在室温下过夜培养。为防止污染，我们加入40mu;g/mL的庆大霉素。第二天，我们将已孵化的L1幼虫通过离心进行收集，并将其重新悬浮在CFcc液体中。我们通过在未接种的CFcc琼脂平板上放置3个1-mu;L滴液并计数每滴液中线虫的数量来测定悬浮液中线虫的密度。

2.4 黄色粘球菌的培养

我们从冷冻库中取黄色粘球菌并将其接种到1.5%的琼脂CTT培养基（10g/L Casitone, 10mM Tris pH 8.0, 8mM MgSO₄, 1mM KPO₄[59]）上，将它在32℃和90%的相对湿度（rH）下培养4-5天，然后我们对得到的菌落的外缘取样，将接种物转移到CTT液中，在32℃、300rpm下振荡1天，直到培养物达到中指数阶段，然后在CFcc液中调整其吸光度（OD₆₀₀）为5。

2.5 猎物细菌的培养

我们将庄氏黄杆菌和大肠杆菌从冷冻液中接种到1.5%的LB培养基（LB, Sigma, St. Louis, MI, USA）中，并在32℃和90% rH条件下培养3天。我们将单个菌落转移到LB液中，在32℃、3

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