水稻转运蛋白——自然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）家族的生物信息学分析外文翻译资料

水稻转运蛋白——自然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）家族的生物信息学分析

原文作者:Anitha Mani, Kavitha Sankaranarayanan

单位:Ion Channel Biology Laboratory, AU-KBC Research Centre, Madras Institute of Technology, Anna University, Chromepet, Chennai, Tamil Nadu 600 044, India

摘要：

在水稻中，NRAMP（天然抗性相关巨噬细胞蛋白）转运蛋白家族有七个成员，它们被鉴定为OsNRAMP1、OsNRAMP2、OsNRAMP3、OsNRAMP4、OsNRAMP5、OsNRAMP6和OsNRAMP7。几种金属离子，如Zn² 、Mn² 、Fe² 、Cd² 等经过研究发现可以通过水稻中的NRAMP转运蛋白来转运。尽管如此，关于这些转运蛋白的信息仍然不足。因此，计算预测和表征OsNRAMP转运蛋白家族十分重要，以便于在未来研究中研究和理解它们的分子机制。为此，采用多种计算机方法和工具表征OsNRAMP转运蛋白家族，如预测蛋白质序列的理化性质、确定跨膜结构域 (TMD) 和保守基序特征、预测转运蛋白家族的相互作用对；使用在线结构预测工具生成OsNRAMP转运蛋白家族所有成员的3D模型，然后对其进行分析；进行计算机微阵列分析以了解这些转运蛋白在水稻中的表达模式。目前，关于这些转运蛋白的结构和功能方面的相关信息有限，因此本研究将提供更多与其相关的理论信息。

关键词：水稻；理化特征；相互作用对；3D模型预测；基因表达分析

1引言

转运蛋白在植物的金属吸收及螯合作用中起着非常重要的作用。目前已经对使用异源表达方式的植物转运蛋白进行了大量研究，细胞膜上的转运蛋白可以作为运输金属和其他离子的载体和通道，而NRAMP（天然抗性相关巨噬细胞蛋白）转运蛋白家族就是这样的转运蛋白家族之一。NRAMP蛋白家族有二价金属转运功能，在从细菌到人类的多种生物中发挥作用^[1]，它们在酵母、植物、苍蝇和哺乳动物之间具有高度的蛋白质序列同一性^[2]。在植物中，NRAMP也转运一系列二价金属阳离子如铁离子、锰离子、镉离子和锌离子^[3]。

大米是许多东南亚国家食用的主要粮食作物。然而大米缺乏许多必需的微量营养素和维生素，而这些微量营养素的缺乏在发展中国家很常见^[4]。在Oryza sativa（水稻）中，已鉴定出7种这样的NRAMP转运蛋白，即OsNRAMP1、OsNRAMP2、OsNRAMP3、OsNRAMP4、OsNRAMP5、OsNRAMP6和OsNRAMP7。

在水稻中的7种NRAMP蛋白中，只有5种具有功能特性。OsNRAMP1的确切作用尚不清楚，但被认为参与Cd的摄取。OsNRAMP4又称Nrat1 ( Nramp铝转运蛋白1 )，是该家族中第一个被鉴定为三价铝离子转运蛋白的转运蛋白^[5]。与其他水稻NRAMP成员相比，OsNRAMP4对Zn、Mn、Fe等二价金属离子没有表现出转运活性。它与其他OsNRAMP成员的相似性相对较低^[5,6]。为了应对环境变化，OsNRAMP3差异运输Mn^[7]。据报道，OsNRAMP5在水稻对土壤中Mn、Fe和Cd的吸收过程中起一定作用^[8]。最近，OsNRAMP6被发现参与铁和锰的吸收^[9]。

此前有报道称，NRAMPs是高度疏水的膜蛋白，含有10-12个假定的TMDs，具有胞浆N和C末端。转运残留物的相同点在于TMD-8和9之间的胞内环路^[2,10]。尽管它在水稻植株中发挥着重要作用，但是关于它们的信息很少，而且这些转运体没有可用的晶体结构。因此，本研究的重点是研究OsNRAMP家族转运蛋白的特性，预测其三维结构，并利用生物信息学工具研究其表达模式。

2材料和方法

2.1 NRAMP转运蛋白的序列提取

OsNRAMP家族转运体蛋白序列来源于水稻注释项目数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/) ^[11,12]。序列ID分别为OsNRAMP1(Os07g0258400)、OsNRAMP2(Os03g0208500)、OsNRAMP3(Os06g0676000)、OsNRAMP4(Os02g0131800)、OsNRAMP5(Os07g0257200)、OsNRAMP6(Os01g0503400)、OsNRAMP7(Os12g0581600)。

2.2转运蛋白NRAMP家族分析

利用Protparam工具(http://web.expasy.org/protparam/) 分析OsNRAMP家族转运蛋白序列的理化特性^[13]。在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/) 中搜索蛋白质结构域家族^[14]。跨膜结构域(TMD)通过TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测^[15]。亚细胞定位由CELLO服务器(http://cello.life.nctu.edu.tw/) 预测^[16]。采用MEME工具( http://memesuite.org/tools/meme)进行Motif分析^[17]，参数如下：最大基序数，5；最小基序宽度，6；最大基序宽度，50。每个基序用蛋白质序列数据库(Swissprot)进行扫描，使用FIMO (找到单个基序的出现)(http://meme-suite.org/tools/fimo) ^[18]。用Innovagen公司的Peptide Calculator(http://pepcalc.com/) ,预测pH7时蛋白质的净电荷等其他理化特性，用Expasy ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/) 预测其溶解度和水解作用图^[13]，窗口大小为19个氨基酸。使用工具Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)^[19]创建百分比单位矩阵。为了推断水稻OsNRAMP转运体之间的进化关系，利用Clustal Omega Phylogenetic tree，使用默认参数构建系统进化树。同样用Clustal omega对水稻NRAMP转运蛋白序列进行比对，默认参数。使用STRING (互作基因/蛋白质检索工具)数据库(http://string-db.org)^[20,21]生成交互网络。它是探索和分析蛋白质-蛋白质关联并进行预测的数据库。

2.3三维结构预测与验证

OsNRAMP转运体的三维结构在RCSB蛋白数据库中不可用。因此，通过I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)^[22]和Robetta (http://robetta.bakerlab.org/)^[23]对OsNRAMP转运体7个成员的模型进行预测。I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement)是一种分级蛋白质结构建模方法^[24,25]。程序从PDB库中检索相似折叠的模板蛋白,如果没有检测到类似的结构，I-TASSER会从头计算对整个结构进行建模。I-TASSER在模拟过程中不考虑二硫键，但其预测模型被认为是正确的，因为它是由全局拓扑而不是局部连接来判断的，该结构不仅由二硫键连接在一起，还具有疏水作用、盐桥作用、范德华作用、氢键作用。通过指定的联系，可以通过对I-TASSER施加额外的约束来完成强制配对。通过网络服务器，可以展开“Option I: Assign additional restraints amp; templates to guide I-TASSER modelling.”，并选择“Assign contact/distance restraints”。

对于三维结构的生成，以OsNRAMP转运体的蛋白序列作为输入。从一个氨基酸序列出发，利用I-TASSER进行多线程对齐和迭代结构装配模拟，生成三维(3D)原子模型。模型根据其置信度得分(c-score)、TM得分、均方根偏差(RMSD)和标准差进行排序。I-TASSER预测模型的准确性是由模型的置信度评分(C-score)提供的。利用PyMOL对预测的结构进行了可视化^[26]。

采用Rampage(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/lopage.php)获得的Ramachandran图评估最终模型的立体化学质量^[27]。这些被用来确定蛋白质三维模型的统计意义，考虑氨基酸的空间位置和结构的整体稳定性。氨基酸环境采用UCLA-DOELAB-SAVES服务器(https://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)的Errat进行评估^[28]。同时，利用ProQ-Protein Quality Predictor(http://www.sbc.su.se/~bjornw/ProQ/ProQ.cgi)确定氨基酸空间位置和结构整体稳定性的三维模型统计显著性^[29]。利用Dali服务器(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/

start)对预测模型与蛋白质数据库现有结构进行了结构比较^[30]。I-TASSER模型与Robetta模型采用Dali两两比较(http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start)^[31]。Dali服务器报告每个匹配的重要性，估计的Z-score是原始的比较评分，由蛋白质的组合长度标准化。

2.4基因表达数据分析

利用RiceXPro(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)^[32,33]，通过检索阵列数据库中的表达值，分析OsNRAMP基因在整个发育周期特异性文库中的组织和器官的电子表达谱。为深入了解OsNRAMP成员在水稻中的表达情况，利用Rice Annotation Project Database IDrsquo;s在RiceXpro数据库中搜索转录本表达。随后用CIMMiner(http://discover.nci.nih.gov/cimminer) ^[34,35]软件生成热图。

3结果

3.1转运蛋白Nramp家族的分析

为了解OsNRAMP转运蛋白的分子特性，对其理化特性进行了研究。所有鉴定的OsNRAMPrsquo;s均含有NRAMP(PF01566)家族结构域。它们编码一个长518~550个氨基酸残基的蛋白质，分子量范围为55.814~59.708kDa，主要表现为基本特征，pI值为5.19~8.48。这些NRAMP转运蛋白被预测定位于质膜(表1)。它们含有10-12个具有胞质N端和C端区域的假定TMD。

表1水稻NRAMP转运蛋白及其特性表

利用ExPASy ProtScale预测OsNRAMP转运体所有7个蛋白序列的亲水性，利用Kyte- Doolittle算法将蛋白质序列中各氨基酸的水解作图，窗口大小为19个氨基酸(图1)。所有蛋白序列均被预测具有较差的水溶性。对于所有的蛋白质序列，用Innovagenrsquo;s Peptide Calculator预测它们在pH7时的净电荷如下，OsNRAMP1 (1.3)；Osnramp2 (-2)；Osnramp3 (3.3)；Osnramp4 (0.1)；Osnramp5 (-0.4 )；Osnramp6 (5.5)和Osnramp7 (-9.7)。

图1 7个Os

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