可可类黑素在模拟乳制品体系中降低膳食晚期糖基化终末产物的形成外文翻译资料

可可类黑素在模拟乳制品体系中降低膳食晚期糖基化终末产物的形成

原文作者：Hao Zhang 单位：江南大学食品学院

摘要：食品中美拉德反应的控制对保持蛋白质的营养质量具有重要意义。在本研究中，我们研究了从不同的烤制可可豆中获得的类黑素化合物对乳清蛋白(WP)和葡萄糖、乙二醛(GO)以及甲基乙二醛(MGO)在35^◦C和pH 7.0的水溶液中形成膳食晚期糖基化终产物(d-AGEs)的影响。可可类黑素(4 mg/mL)对GO衍生的d-AGEs的抑制效果优于对MGO衍生的d-AGEs,在 WP/GO体系和WP/MGO体系中，N-ε-羧甲基赖氨酸和甲基乙二醛-氢咪唑酮的生成分别降低74.4%和48%。此外，在WP/葡萄糖模型系统中，通过糠氨酸测定的蛋白结合N-ε-果糖氨基赖氨酸(N-ε-果糖氨基赖氨酸)在可可类黑素存在时下降至57.2%，表明在早期阶段对美拉德反应作出有效控制。这些发现强调了可可类黑素是一种功能性成分，能够在储存期间减轻乳制品中的蛋白质糖基化。

关键词：可可类黑素；Amadori化合物；美拉德反应；alpha; -二羰基；膳食晚期糖基化终产物(d-AGEs)

1. 介绍

晚期糖基化终产物(AGEs)是在美拉德反应中形成的一组非均相化合物(Poulsen et al.， 2013)。焦糖化反应和美拉德反应诱导形成的包括3-脱氧葡萄糖醛酮 (3-DG)、乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)在内的alpha; -二羰基化合物(DCs),可以随时与蛋白质或多肽的氨基末端、赖氨酸ε氨基酸组,胍基精氨酸或硫醇基的半胱氨酸残基反应进而导致一连串的产物生成,如N -ε-羧甲基赖氨酸(CML)、N -ε-羧乙基赖氨酸(CEL)、甲基乙二醛-氢咪唑酮(MG-H1)和S-(羧甲基)半胱氨酸(Hellwig amp; Henle, 2014)。糖基化蛋白是在食品加工和长期储存过程中形成的;由此形成的膳食晚期糖基化终产物(d-AGEs)导致蛋白质消化率降低，必需氨基酸的生物利用度降低(Zenker, van Lieshout, van Gool, Bragt,amp; Hettinga, 2020;Zhao et al.,2017)。在体内，从游离糖基化氨基酸到大型糖基化蛋白质等生理条件下都会形成AGEs。在病理生理条件下，如糖尿病和神经退行性疾病，促氧化剂和炎症环境也会进一步促进糖基化和氧化反应，导致AGEs，特别是低转化率蛋白质的高积累(Rabbani amp; Thornalley, 2020)。目前尚不清楚d-AGEs如何转化成内源性晚期糖基化终产物，不同d-AGEs所导致的结果也不同(Delgado-Andrade amp; Fogliano, 2018)。一些研究建议减少食品加工和储存过程中d-AGEs的形成，同时需要仔细区分游离d-AGEs和蛋白质结合d-AGEs(van Boekel et al.,2010;Zhao et al.,2019)。

包括调味奶在内的乳制品类食品在世界各地广泛消费(Bisig amp; Kelly, 2017)。乳制品的工业化生产要求热处理，以确保食品的安全和长保质期。因此，由于长期储存和成分复杂的综合影响，美拉德反应很容易发生在奶制品中(Mehta amp; Deeth, 2016)。(Zhang et al.2019)最近报道，CML、CEL和MG-H1/H3可以作为评价传统和乳糖水解超高温牛奶储存过程中美拉德反应程度的指标。在乳蛋白中，乳清蛋白(WP)作为食品中主要成分，在热处理和储存过程中发生化学变化，与酪蛋白相比，产生d-AGEs的浓度更高(Pischetsrieder amp; Henle, 2012)。在美拉德反应控制策略框架中,多酚抵抗蛋白质糖基化的能力已经有所研究，比如用于奶制品中的表儿茶素(Zhu, Poojary, Andersen, amp; Lund, 2020)、染料木黄酮(Kong, Li, Zheng, amp; Lv, 2015)、甜菜根汁(Raˇckauskiene et al., 2015)和橄榄加工废水中的环烯醚萜类衍生物(Troise et al ., 2014)。

随着抗氧化提取物的添加，食品加工过程中还可能使用复杂的多糖和蛋白质的大分子聚合物，如类黑素是提高“食品天然性”的有效替代物，可以减少人工添加剂和防腐剂的使用(Roman, Sanchez-Siles, amp; Siegrist, 2017)。类黑素是一种棕色的多相高分子量聚合物，在食物中经过严格的热处理后形成，如咖啡和可可豆的烘烤。有研究提出，类黑素可以在食品系统中作为抗氧化剂膳食纤维发挥功能和健康特性(Mesiacute;as amp; Delgado-Andrade, 2017;Morales, Somoza,amp; Fogliano, 2012)和影响肠脑反应和能量摄入(Walker et al., 2020)。

我们的研究小组最近指出了类黑素清除二碳基的能力：富含多酚类的类黑素，如咖啡类黑素，可以在生理条件下有效清除DGs (Zhang, Zhang, Troise,amp; Fogliano, 2019)。可可豆的烘焙参数(时间/温度组合)可以通过改变类黑素的化学组成，特别是类黑素结合多酚的数量来影响这种活性。(Oracz, Nebesny amp; Zyzelewicz, 2019)最近报道，在可可类黑素中，非共价和共价结合酚类化合物的总含量分别为12.56 ~ 33.24 mg/100 g干重和407.16 ~ 649.02 mg/100 g干重，这取决于烤焙温度和时间。然而，焙烧参数对类黑素抑制蛋白质糖基化能力的影响以及可能的抑制机制尚不清楚。

由于可可味牛奶是最受欢迎的饮料之一，特别是对儿童来说。在本研究中，我们研究了在模拟超过21天的存储条件下，WB/葡萄糖或WB/二羰基模型中，可可类黑素对乳清蛋白糖基化的抑制作用。环境温度(35^◦C)是模拟跨大洲运输的极端存储条件，那里的温度超过35^◦C (Deeth amp; Lewis, 2017;Karlssonet al.,2019)。此外，还阐明了这种作用的可能机制。

2. 材料与方法

2.1 化学试剂

乙二醛水溶液（GO，40%）、甲基乙二醛水溶液（MGO，40%）、喹喔啉、二乙烯三胺基乙酸（DETAPAC）、邻苯二胺(OPD)、邻苯二甲醛（OPA）、氨基胍和叠氮钠，均购自Sigma-Aldrich公司。分别从德国默克公司购得盐酸(37%)、二水磷酸氢二钠、D-( )-水葡萄糖、二水磷酸二氢钠和乙酸。N-ε-羧甲基赖氨酸(CML)、N-ε-羧甲基赖氨酸-d₂ (CML-d₂)、糠氨酸和糠氨酸-d₄分析标准品购自法国斯特拉斯堡多肽实验室。N-ε-羧基乙基赖氨酸(CEL)和N-ε-羧基乙基赖氨酸d₄ (CEL-d₄)购自加拿大多伦多的TRC-Chemicals公司，甲基乙二醛-氢咪唑酮三氟乙酸盐(MG-H1)购自德国Iris Biotech GmbH。

2.2 可可样品

可可豆干样品(Forastero)由墨西哥的CACEP提供。生样品手工去皮，在实验室对流炉(HBG76S651E，博世，慕尼黑，德国)分批烘烤200 g。在表1所示的四种不同的焙烧参数下进行三次焙烧过程，得到四种焙烧可可豆：低焙烧可可豆(LR-CO)；中间焙烧可可豆1(IR-CO-1)；中间烘焙可可豆2(IR-CO-2)；黑烤可可豆(DR-CO)。烘焙结束后，将可可豆在通风柜中冷却20分钟至室温作进一步处理。

2.3高分子量可可类黑素的准备

根据(Summa et al., 2008)的方法，通过四种不同的焙烧工艺得到了高分子量的可可类黑素，分别为低焙烧可可类黑素(LR-COM)、两种中间焙烧可可类黑素(IR-COM-1和IR-COM-2)和黑焙烧可可类黑素(DR- COM)。即将200 g烤好的可可豆磨成细粉，再通过用石油醚脱脂。脱脂可可粉室温风干过夜，80^◦C水(1:10,w/v)提取20分钟。5000 times; g离心10分钟，上清液用Whatman 595滤纸过滤，去除不溶性物质。然后，滤液(400 mL)使用透析膜(MW切断gt; 12.4 kDa, Sigma-Aldrich)透析3天，4 L水在4◦C条件下不断搅拌。换水10次，直到电导率仪(WTW InoLabTM Cond 7110, Fisher Scientific, 瑞典)检测到的电导率低于2.0micro;S/cm。透析后，保留液在minus;20^◦C冷冻并冻干。所有获得的可可类黑素存储在minus;20^◦C备用。

2.4游离氨基和二羰基化合物的定量研究

用邻苯二醛(OPA)法测定与DCs孵化前和孵化后的类黑素中的游离氨基，以估计氨基与DCs之间可能的反应。GO(6.4 mM)、MGO (6.4 mM)和四种类黑素(10 mg/ mL)溶液用磷酸盐缓冲液(100 mM, pH 7.0)制备得到。GO/MGO(240 micro;L)或磷酸盐缓冲液(阴性对照)与240 micro;L不同的类黑素溶液和720 micro;L磷酸盐缓冲液混合，35^◦C下孵育2、5和7天。孵育后，将1 mL样品与200 micro;L 0.2%含DETAPAC (9.6 mM)的OPD溶液混合，按照(Zhang et al., 2019)的方法测定剩余的DCs。混合物在室温黑暗中保存3小时，使用0.22 micro;m聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器过滤，然后进行UHPLC-MS/MS分析，如第2.7段所述。其余样品(200 micro;L)按照之前的方法进行OPA分析(Park, Albright, Cai，amp; Pariza, 2001)。加入新鲜制备的OPA试剂(1500 micro;L)，室温孵育120 s后，用紫外-可见分光光度计(Cary 50 Varian, Palo Alto, CA)在340 nm处测定吸光度。用L-丝氨酸标准溶液(范围为20 ~ 150 mg/L)，在与黑素类样品相同的孵育条件下得到校准曲线。

2.5可可类黑素对WP/GO、WP/MGO或WP/葡萄糖反应模型的影响

乳清蛋白和葡萄糖的浓度基于巧克力牛奶(5% -9% 碳水化合物和3.2 -3.6%蛋白质)(Roy, 2008)，根据脱脂可可粉的添加量（1%-15%）(Bisig amp; Kelly, 2017)以及脱脂可可粉水溶液的类黑素的提取率(13.7% - 26.0%)(Quiroz-Reyes amp; Fogliano, 2018)测定巧克力牛奶中可可类黑素浓度在1.37 mg/mL至39 mg/mL之间波动。WP (35 mg/mL)、GO (6.4 mM)、MGO (6.4 mM)、葡萄糖 (1 M)、氨基胍(6.4 mM)和4种类黑素(10 mg/mL)溶液由100 mM的磷酸盐缓冲液(100 mM, pH 7.0)制备得到。WP(250 micro;L，含0.2%叠氮化钠)与500 micro;L的GO、MGO或葡萄糖溶液，以及500micro;L的磷酸盐缓冲液(阴性对照，NC)、氨基胍(阳性对照)或上述四种类黑素溶液混合。WP/GO和WP/MGO模型系统在35^◦C孵育2,5,7和14天，而WP/葡萄糖模型系统在35^◦C孵育7,14和21天。孵育后，使用0.5 mL孵育样品分析上述WP/GO和WP/MGO模型中的DCs损失，其余样品进行酸性水解和HILIC串联质谱测定CML、CEL、MG-H1和糠氨酸(见下文)。

2.6可可类黑素对GO和MGO生成的影响

将500 micro;L葡萄糖(1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0, 含0.04%叠氮化钠)与750 micro;L磷酸盐缓冲液或250 micro;L磷酸盐缓冲液和500 micro;L IR-COM-1溶液(10 mg/mL)混合。混合物在35^◦C孵育7,14和21天，GO和MGO的形成分析如上所述。

2.7喹喔啉衍生物的测定

喹喔啉衍生物的测定采用Thermo Ultimate 3000 UHPLC系统和TSQ三重四极杆质谱联用仪(购自德国不来梅赛默费舍尔科学公司)进行测定。采用Kinetex EVO C18色谱柱(150 mm times; 2.1 mm, 2.6micro;m, Phenomenex, torance, CA)对喹喔啉衍生物进行分离，C-18前柱流动相：(a) 0.1%甲酸水溶液和(B) 0.1%甲酸甲醇溶液。化合物以0.4 mL/min的速度通过以下梯度洗脱(t in [min]/[%B]):(0/2)，(2/2)，(8/25)，(10/50)，(13/95)。采用阳离子电喷雾法，设置如下：喷雾电压4.0 kV；毛管温度350◦C；停留时间100ms；鞘气和辅助气体设置为10.0和5.0 AU(任意单位)。分别使用以下条件(区间内碰撞能量,CE): m / z 131→77 (CE: 25 V)和m / z 145→77 (CE: 28 V)对GO和MGO的喹喔啉衍生物进行选择性反应监测。通过使用外部标准校准曲线的范围0.02 -20.0 mg / L (日内和日间试验R² gt; 0.999)计算喹喔啉衍生物和2-甲基喹喔啉浓度。俘获容量用各二羰基化合物(DC)的下降百分率表示，公式如下(式(1))：

俘获容量(%)=（空白中DC量minus;样品中DC量）/空白中DC量times; 100% (1)

2.8超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS /MS）测定d-AGEs和蛋白结合赖氨酸A

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