金黄色葡萄球菌耐药性及其机制研究
Ebru Scedil;ebnem Yilmaz1 Ozkan Aslantas2
1土耳其安塔基亚-哈塔伊穆斯塔法凯末尔大学-艺术与科学学院生物系
2土耳其安塔基亚-哈塔伊穆斯塔法凯末尔大学-兽医学院微生物系
摘要：本实验探讨97株临床金黄色葡萄球菌对14种抗菌药物的耐药性及相应耐药机制。采用纸片法法测定了分离株的抗菌敏感性，使用聚合酶链反应筛选扩散法和耐药性基因，用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序法检测对环丙沙星和利福平耐药的突变。所有菌株均对万古霉素敏感，对青霉素(83.5%)、氨苄西林(77.3%)、红霉素(63.9%)、特雷西林(16.5%)、阿莫西林/克拉维酸(16.5%)、西普氟沙星(15.5%)、三甲氧菊酯/苏苏甲恶唑(15.5%)、苯唑西林(13.4%)、呋喃地酸(12.4%)、利福平耐药(6.2%)、庆大霉素(6.2%)和莫匹洛辛(6.2%)的耐药率均有不同程度的鉴定。耐环丙沙星的菌株在Gyra基因上有84密码子(Ser84Leu)和106密码子(Gly106Asp)的突变，grlA的突变主要与Ser80Phe替换有关，所有耐利福平分离株均检测到rpoB基因的Leu466Ser突变，所有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均为SCCmee V型。分离株对不同种类抗菌药物的耐药率不同，耐药机制不同，因此，对金黄色葡萄球菌耐药的持续监测是控制其对临床重要抗菌药物耐药性的必要手段。
关键词：金黄色葡萄球菌;耐药性; 耐药机制点突变;
1.引言
金黄色葡萄球菌是人类最常见的致病菌之一[1]，在男性和所有年龄组都会引起不同的感染后遗症。耐金黄色葡萄球菌的出现和传播，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),对全球构成了挑战[2]。治疗这些细菌引起的感染，由耐药细菌引起的感染延长了住院时间，增加了医疗服务的成本，最重要的是，导致发病率和死亡率显着增加[3]。
金黄色葡萄球菌通过不同的机制产生对抗菌药物的耐药性。这些机制包括限制药物的吸收、改变药物靶点、酶灭活药物和药物的活性外排。在抗微生物的作用下，细菌可能使用其中的一种或几种耐药机制，尤其是在质粒和转座子等可转移的基因元件上的导入基因定位促进了细菌间的水平转移[4]。
快速准确地确定抗菌药物耐药表型和耐药机制具有重要意义，不仅对治疗方案而且对公共卫生风险都有重要意义[5]。 本研究采用纸片扩散法对哈塔伊，土耳其不同临床标本中97株金黄色葡萄球菌的敏感性进行了检测，并对其分子机制进行了初步探讨。
2.材料与方法
2.1细菌分离株
从医院微生物实验室(Hatay)的各种临床标本中分离出97株金黄色葡萄球菌，如伤口拭子(63，64：90%)，尿液(17，17.50%)，血培养(3，3.10%)，痰(4，4.12%)和其他标本1，1.03%)，对其进行了抗菌和分子分析，并对其进行了标准生化试验。菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶反应、试管凝固酶试验等。
2.2抗菌药敏试验
根据临床实验室标准指南（CLSI）[7]，采用纸片扩散法测定菌株对抗菌药物的敏感性：万古霉素(VA，30 ug)、青霉素(P，10 U)、氨苄西林(AM，10mu;g)、红霉素(E，15mu;g)、四环素(TE，30mu;g)、阿莫西林-克拉维酸(AMC，20 ug/10)、环丙沙星(CIP，5mu;g)、三甲基普林-磺胺甲恶唑(SXT，1.25mu;g/23.75)、苯唑西林(Og，1mu;g)、呋喃西林(FA，10mu;g)、福喜霉素(10mu;g)、环丙沙星(CIP，5mu;g)、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(SXT，1.25mu;g/23.75)、苯唑西林(Og，1)、呋喃西丁酸(FA，10mu;g)、福美其林(RA)、庆大霉素(5mu;g)、庆大霉素(Mu)、庆大霉素(10mu;g)。这些抗菌药物的结果如前所述进行解释[8,9]。金黄色葡萄球菌ATCC 29213也用作质量控制标准。至少对三种不同抗菌药物耐药的菌株被认为是多药耐药。
2.3苯唑西林纸片扩散法实验
按CLSI标准进行苯唑西林药敏试验[7]推荐使用1mu;g苯唑西林片，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923(敏感株)和金黄色葡萄球菌ATCC 43300(耐药株)为对照。
2.4抗菌药物耐药基因和突变的测定
根据之前描述的方法制备细菌DNA样品[10]。 大环内酯（ermA，ermB，ermC，msrA，mphC）[11-13]，林可酰胺（lnuA）[14]，氨基糖苷（aac（6） - aph（2“），aph（3） 研究了四环素（tetK，tetM）[16]，莫匹罗星（ileS-2）[17]和夫西地酸（fusB，fusC）[18]。
为了确定突变，我们扩增了grlA(469 Bp)、Gyra(398 Bp)和rpoB(1052 Bp)基因，并对扩增产物的核苷酸序列进行了商业上的亚定量测定。与已发表的序列(金黄色葡萄球菌D 67074和D 67075的grlA基因、金黄色葡萄球菌D 10489的Gyra基因、金黄色葡萄球菌cAA 45512的rpoB基因)进行比较，确定突变情况[19-22]
2.5 SCCmec 分型
使用Kondo等人描述的方法和引物，确定了mecA阳性菌株的SCCmec类型[23]。 根据ccr和mec基因复合物对分离株进行SCCmec分配。
3.结果
3.1药敏实验
结果表明，在97株金黄色葡萄球菌中（表1给出了金黄色葡萄球菌分离株的分离情况），9株(9.3%株)对抗菌药物敏感，对文可辛无耐药性，对青霉素(83.5%株)、氨苄西林(77.3%株)、红霉素(63.9%株)、阿莫西林/克拉维酸(16.5%株)、四环素(16.5%)、环丙沙星(15.5%株)和甲氧苄啶/磺胺唑(15.5%株)耐药，其次是苯唑西林(13.4%株)、呋喃西林(12.4%)、利福平(6.2%)、克林霉素(6.2%)、庆大霉素(6.2%)和米非昔林(CRIC)。28株(28.7%株)菌株对多药耐药，3株(10.7%株)、1株(3.6%)、3株(10.7%)、6株(21.49%)、7株(25%)和8株(28.6%)菌株分别检测出多重耐药株和8株(28.6%株)。
表1 金黄色葡萄球菌中确定的表型抗性分离株
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表型 |
没有分离 |
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OXA, P, AMP, AMC, MUP, CIP, FA, SXT, TE, CN, E OXA, P, AMP, AMC, RA, CIP, FA, SXT, DA, TE, E OXA, P, AMP, AMC, MUP, FA, SXT, DA, CN, E OXA, P, AMP, AMC, CIP, SXT, TE, CN, E OXA, P, AMP, AMC, RA, CIP, FA, SXT, E P, AMP, AMC, RA, CIP, DA, TE, E P, AMP, AMC, MUP, CIP, DA, TE P, MUP, CIP, SXT, DA, TE, CN, E P, AMP, AMC, RA, CIP, TE, E P, AMP, AMC, CIP, DA, TE, E OXA, P, AMP, FA, TE, E OXA, P, AMC, FA, SXT, E P, AMP, AMC, CIP, TE, E P, AMP, AMC, CIP, TE, E P, AMP, MUP, FA, SXT, E OXA, P, AMP, SXT, CN, E P, AMP, AMC, CIP, E FA, SXT, TE, CN, E P, AMP, CIP, TE, E OXA, P, RA, SXT, E OXA, P, AMP, E P, AMP, AMC, E P, AMP, AMC, E P, AMP, E, TE P, AMP, FA, E P, AMP, FA P, AMP, CIP P, AMP,TE OXA, P, E P, SXT, E P, AMP, E P, AMP FA, TE SXT, E E 泛易感 |
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 28 20 1 2 3 9 |
3.2抗性基因的分布
对红霉素耐药菌株(n=62)中，57株(91.9%)、20株(32.3%)17(27.4%)、12株(19.4%)和4株(6.5%)分别检测到ermC、MsrA、mphC、Erma和ermB，其中16株(n=16)、9株(56.3%)含tetK(43.7%)，6株庆大霉素耐药株(3(50.0%))同时携带AAC(6lsquo;/aph(2“)和aph(3)-Lilla、2(33.3%)Aac(6rsquo;/aph(2和1(16.7%)aph(3)llla-llah)和1(16.7%)aph(3)lllaz和mecech(1 16.7%)aph(3)，分别检测到6株金黄色葡萄球菌和6株金黄色葡萄球菌，分别检测到6株耐药株(n=62)、ermC、mphC、Erma和ermB。其中3株(50.0%)同时携带AAC(6lsquo;/aph(2“)和aph(3)-Lilla、2(33.3%)Aac(6rsquo;/aph(2)”和1(16.7%)aph(3))。在5个耐药菌株中检测到与莫匹罗卡菌耐药相关的Iles-2基因。
3.3喹诺酮和利福平基因突变
在15株耐环丙沙星金黄色葡萄球菌中，共观察到6个不同组合的grlA和Gyra基因突变。在7个分离株中检出了Ser80Phe和Gyra突变，3个分离物中Ser84Leu和GER106Asp的Ser80Phe和Gyra突变均为8rlA突变，其中两个分离物的grlA和Ser84Leu-Gly106Asp中均有Ser80-Phe和Ser84Leu-Gly106Asp突变，其中一个菌株在grlA(Ser80Phe-Glu84Asp)、Gyra(Ser84Leu)和Ger80Phe(Ser84Leu)和grlA中均有突变。利用Glu88Lys-Glyl06Asp基因Gyra突变，在一个分离株中检测到了Glu 88Lys-Glyl06Asp基因的Leu466Ser点突变，是利福平分离株中唯一的替换。
3.4 SCCmec 分型
所有MRSA菌株仅呈现的SCCmec型V.
4.讨论
随着抗生素的广泛传播，耐药性已成为土耳其重要的公共卫生问题。限制抗菌药物在治疗中的使用。本研究通过表型试验和基因型试验，对来自不同临床资料的金黄色葡萄球菌的耐药性进行了研究。
在我们的研究中，金黄色葡萄球菌对青霉素(83.5%)和氨苄西林(77.3%)的遗尿率较高，这并不奇怪，因为p-内酰胺类药物是治疗火鸡传染病的常用药物。在土耳其进行的前期研究显示，beta;-内酰胺耐药率较高；在哈泰进行的一项研究表明，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率为92.8%。Ragbetli等251株评价了金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性。根据2009年至2014年的数据，并确定了这些年对青霉素G的耐药率为100%，红霉素耐药率(63.9%)与Hatay[24]的耐药率为60.4%相一致，但与Callk等人先前的研究结果不一致[26]在卡尔斯和Ragbetli等人[25]在Van.杯等[26]报告在对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)中的耐药率为38.7%，在MRSA.Ragbetli等人中报告的耐药率为84.3%。
Ragbetli等人<su
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