米淀粉生产RS4及其作为包封剂应用于靶向递送

益生菌的研究

原文作者：Bilal Ahmad Ashwar a, Asir Gani b, Adil Gani a, Asima Shah a, Farooq Ahmad Masoodi a

单位：a Department of Food Science and Technology, University of Kashmir, Srinagar 190006, India
b Department of Food Technology, Faculty of Agro-Industry, Prince of Songkla University, Hat Yai, Songkhla 90112, Thailand

摘要：本文所报道的研究是基于淀粉交联使其成为可能的假设通过改变其消化来靶向递送益生菌的潜在壁材料。三种益生菌菌株即干酪乳杆菌，短乳杆菌和植物乳杆菌微囊化抗性淀粉。抗性淀粉微球的包封率（％）为43.01〜48.46。抗性淀粉微粒的平均直径在45.53-49.29微米范围内。微胶囊的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱显示在900-1300cm -1和2918-2925cm -1，这对应于细菌的存在。差分扫描量热计（DSC）显示抗性淀粉微胶囊具有更好的热稳定性。微胶囊化的益生菌在模拟胃肠道条件和不利热中存活良好条件。微胶囊化乳酸杆菌的生存力也很高（gt; 7log cfu g1）4℃时2个月。结果显示抗性淀粉是潜在的口服新递送载体。

关键词：益生菌；RS4；微胶囊；乳化；有针对性的交付

介绍

益生菌被定义为活的微生物，赋予a足够的时间给予宿主健康益处数额（粮农组织/世卫组织，2001年; Homayouni，2009年）。他们可以提供保持健康的肠道对人体有益的作用微生物群，抑制病原菌生长，缓解便秘，刺激免疫系统，合成维生素和抗菌剂，以及改善吸收钙（Rokka＆Rantamaki，2010; Homayouni Rad，Torab，Ghalibaf，Norouzi，＆Mehrabany，2013）。然而，为了益生菌发挥这些有益效果，它们的高生存力应该在通过上消化道后保存在肠道中。胃和胃的酸性条件胆汁盐分泌到十二指肠是主要障碍摄入的细菌的存活（DeCastro-Cislaghi，Silva，Fritzen-Freire，Lorenz和Anna，2012）。由于益生菌有许多健康益处，因此迫切需要开发新的保存方法他们的生存能力。此外，对于功能性食品的开发，其具有足够量的活细胞存活期间的益生菌加工和储存食物也是必不可少的（Homayouni，Azizi，Javadi，Mahdipour，＆Ejtahed，2012）。

微胶囊化是细菌细胞的一种有前途的技术保护和一些研究调查了保护作用该技术针对益生菌的不利条件可以暴露（De Castro-Cislaghi，Silva，Fritzen-Freire，Lorenz，＆Anna，2012; Sultana等，2000）。最近的微胶囊化也被发现是一种有用的技术来稳定功能性食品应用中的益生菌（Sathyabama，Kumar，Devi，Vijayabharathi和Priyadharisini，2014）。几种封装技术，如乳化，挤出，喷雾干燥和喷涂已报道了凝聚（Heidebach，Forst，＆Kulozik，2012）。然而，考虑到保留细胞活力的成本，简单和温和的制剂条件，乳化技术被广泛使用（Homayouni，Azizi，Ehsani，Yarmand，Razavi，2008; Homayouni，Ehsani，Azizi，Yarmand和Razavi，2007）。乳液技术具有在较短时间内大规模生产微球的潜力（Takei，Yoshida，Hatate，Shiomori，＆Kiyoyama，2009），这对于商业来说至关重要应用。用于乳化技术，多糖水溶液溶液分散在油相中以形成W / O乳液和CaCl 2然后在连续搅拌下加入溶液进行乳化和益生菌（Mokarram，Mortazavi，Najafi，Shahidi，2009年）。

用于封装的最常见的墙壁材料是食品级生物聚合物，如藻酸盐，环糊精，壳聚糖，黄原胶，乳清蛋白，明胶和淀粉（Homayouni等人，2014; Wani等，2016）。 淀粉经常与藻酸盐一起用作益生菌的包封剂（Mirzaei，Pourjafar，＆Homayouni，2012; Sultana等，2000）。 大多数这些报告使用高直链淀粉淀粉来利用它的优势益生元特性，除了它的非特异性包封剂能力。

抗性淀粉（RS）是那部分逸出的淀粉在小肠中消化并因此可以发酵冒号（Ashwar，Gani，Shah，Wani，＆Masoodi，2015）。能力，技能的抗性淀粉能够逃脱消化在小肠中的反映其作为靶向递送益生菌的壁材料的潜力进入结肠（Ashwar等，2015）。由于抗性淀粉的这些健康益处，已经采用了不同的技术为其准备。这些包括水热处理，退火，部分凝胶化和重结晶，高压灭菌，支链淀粉酶脱支，温度循环退化，磷酸化，羟丙基化，乙酰化，氧化和柠檬酸改性（Ashwar，Gani，Shah，＆Masoodi，2017;Ashwar等，2016）。 Sang，Seib，Herrera，Prakash和Shi（2010）报道了通过淀粉磷酸化产生抗性淀粉（RS4）。庄，Panyoyai，Katopo，Shanks和Kasapis（2016）报道了钙离子与钙离子的相互作用磷酸盐和淀粉的羟基产生致密结构。密集的结构可以用作包封材料靶向递送益生菌。

据我们所知，没有关于耐药性表征的数据淀粉类型4（RS4）作为包封剂和用于靶向递送益生菌的益生元已经公布。 这项工作是因此打算开发RS4，其随后用于包封三种益生菌细菌培养物，即植物乳杆菌，干酪乳杆菌和短乳杆菌。该微胶囊的微观结构和热稳定性，微胶囊的存活性在模拟胃肠道条件下包封益生菌和他们在储存过程中的生存能力也与调查为生物技术或食品工业的潜在应用生产足够可行的益生菌的目标。

材料和方法

2.1材料

益生菌的来源，短乳杆菌（MTCC 01），干酪乳杆菌（MTCC 297）和植物乳杆菌（MTCC 021）是从国家乳制品研究所Karnal购买的，印度（NDRI）。这些益生菌培养物在无菌条件下被活化MRS肉汤（HiMedia Laboratories Pvt Ltd，孟买，印度）和在37℃孵育24小时。之后，收集细胞根据Rajam，Karthik，Parthasarathi，Joseph等人的方法Anandharamakrishnan（2012）。所用的所有化学试剂本研究属于分析等级。

2.2.提取淀粉

大米淀粉根据碱浸提取由Ashwar等人描述的方法。 （2016）。提取的淀粉分析了水分（925.10），蛋白质（920.87），脂肪（920.85）和灰分（923.03）根据AOAC（1990）的方法。

2.3.交联磷酸化大米淀粉的制备

磷酸化大米淀粉制备方法根据文献由Woo和Seib（2002）描述。

2.4.抗性淀粉含量

用Megazyme测定抗性淀粉含量检测试剂盒（Megazyme International，Wicklow，Ireland），以下经批准的AACC方法32-40（AACC，2000）。简而言之，100毫克样品和4mL酶混合物（胰alpha;-淀粉酶和胰蛋白酶）淀粉葡糖苷酶）加入到每个试管中，涡旋混合物然后在37℃（200℃）振荡水浴中孵育16小时行程/分钟）以水解可消化的淀粉。在培养期结束时，将悬浮液与4mL无水乙醇混合涡旋使酶失活，RS恢复离心沉淀（1500g，10分钟）。沉淀用水洗50％乙醇两次以除去消化的淀粉。沉积物通过剧烈搅拌将其溶解于2mL的2M KOH中在冰浴中20分钟。该溶液用8mL中和乙酸钠缓冲液（1.2M）。将溶液与淀粉葡糖苷酶（0.1mL，3300U / mL）混合，然后在37℃水浴中温育50℃30分钟，然后将样品在3000g离心10分钟。加入3 mL葡萄糖氧化酶 - 过氧化物酶 - 氨基安替比林（GOPOD）加入到上清液的等分试样（0.1mL）中，并且混合物在50℃孵育20分钟。吸光度是使用分光光度计在510nm处测量。抗性淀粉计算为葡萄糖的量0.9。每个样品都是一式三份分析。

2.5.封装

Sultana等人稍作修改的方法。 （2000）被使用。通过混合2g / 100mL抗性淀粉来制备浆料和3mL培养液分别加入1mL。混合物是以1：1的比例落入油中。向该混合物中加入0.02mL / 100mL加入吐温80。之后，将混合物均化在1500转/分下搅拌10分钟直至其乳化并呈现奶油状。然后将混合物滴入0.1mol / L氯化钙中解。将珠子放置30分钟，通过离心分离并用含有5mL / 100mL的0.9g / 100mL生理盐水洗涤甘油，冷冻干燥并保存在4℃。2.6。使用ATR-FTIR进行确认研究使用FTIR光谱仪记录样品的光谱系统（Cary 630 FTIR，安捷伦科技公司，美国），加上一个ATR配件。分析在室温下进行，并使用Resolution Pro软件版本2.5.5（Agilent Technologies，USA）在400-4000cm -1范围内以4cm -1的分辨率采集光谱。

2.7.热分析

R RS4微胶囊的热特性如熔化用差示扫描量热计（DSC-1STARe System，Mettler-Toledo）研究熔融温度和熔化焓。将3.5mg样品称重到铂盘中并蒸馏加入水（8.0L）。 锅保持在室温下分析前一小时。 样品以10℃/分钟加热从20到200？C。 一个空白的铂盘被用作参考。

2.8微胶囊的形态表征

微胶囊的形态使用扫描电子显微镜（SEM）（日立S-300H-东京，日本）。 将冻干的微胶囊置于粘合剂上胶带附着在圆形铝标本上。 涂层后与金钯垂直，样品拍摄于加速器电位为5千伏。

2.9 评估微胶囊的尺寸分布

通过激光测量微胶囊的尺寸分布衍射粒度分析仪（Shimadzu SALD-2300）使用水作为测量溶剂。 结果表示为体积加权平均直径。 粒度分布以跨度因子表示（Elversson，Millqvist-Fureby，Alderborn，＆Elofsson，2003），其定义如下Span（frac14;deth;v; 90）DDV;10= DDV;50其中d（v，10），d（v，50），d（v，90）对应于直径累计样本量低于10％，50％和90％respectivel。

2.10.水的活动

用Pre水活度分析仪测量水分活度（Aqua lab，Decagon Devices，INC，USA），样品在25℃稳定30分钟。

2.11.包封率和储存稳定性

为了测定包封率，将1克微胶囊化的益生菌重新悬浮于无菌磷酸盐缓冲液中（9mL，0.1mol / L，pH7.0）。之后它被同质化使用均质器（Witeg Labortechnik有限公司）。通过将它们铺在MRS琼脂平板上并孵育48小时来测定培养物的集落形成单位（cfu g -1）在37℃。包封率（EY）（％）通过使用Picot和Lacroix方程（2004）安永= N =否100其中N是活性包埋细胞的对数细胞数（cfu）从微球释放，并且No是日志细胞数量（cfu）在生产微球期间添加到生物聚合物混合物中的游离细胞。用于确定包封物的储存稳定性益生菌在4°C，日志细胞计数（cfu）计算为在每隔15天的间隔后2个月内。

2.12模拟胃液的生存（SGJ）

为了制备模拟胃液，3g / L胃蛋白酶是悬浮于无菌生理盐水（9g / L）中并将pH调节至3.0用1.0 mol / L HCl（Shah，Gani，Ahmad，Ashwar和Masoodi，2016）。然后将0.2g包封的益生细胞（储存4℃）和将游离细胞重悬于模拟胃液（10mL）并在37℃连续温育5,30,60和120分钟在50rpm下搅拌。封装以及封装的可行数量SGJ中的游离细胞被确定为log cfu g1。

2.13.模拟肠液存活（SIJ）

通过混合1mg / mL来制备模拟肠液胰酶（Sigma aldrich）和7mL（v / v）新鲜鸡胆汁和用0.1M NaOH将pH调节至8.0（Shah，Gani，Ahmad，等），2016）。然后0.2g包封的益生菌细胞并游离收获细胞并重悬于模拟肠液中。在37℃孵育6小时后，测定活菌计数作为log cfu g1。

2.14.在热处理下微囊化细胞的存活

将微胶囊化的和游离的益生菌细胞进行处理按照Shah，Gani，Ahmad，等人。 （2016），Shah，Gani，Ashwar等人。 （2016）。一克将微胶囊化的和游离的益生菌细胞转移放入装有10mL无菌蒸馏水的试管中在55℃，65℃和75℃下热处理1分钟和10分钟。

2.15.统计分析

报告的数据是三次观测的平均值。一个方差分析与5％的显着性水平进行了邓肯的测试适用于确定手段之间的差异使用商业统计软件包（IBM SPSS statistics 21。墨水）。

结果与讨论

3.1.大米淀粉的组成分析

淀粉分析揭示了水分，蛋白质，灰分和脂肪8.01plusmn;0.58,0.48plusmn;0.03,0.66plusmn;0.04和0.28plusmn;0.05％。低蛋白质，脂肪和灰分含量表明淀粉非常纯净并且没有残余蛋白质。

3.2.抗性淀粉含量

天然大米淀粉抗性淀粉含量为4.42plusmn;0.81％并通

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