丹参毛状根培养中丹参酮生物合成途径的代谢工程研究外文翻译资料

丹参毛状根培养中丹参酮生物合成途径的代谢工程研究

原文作者 Guoyin Kai , Hui Xu , Congcong Zhou, Pan Liao, Jianbo Xiao, Xiuqin Luo, Lijia You, Lin Zhang

单位 植物生物技术实验室，生命与环境科学学院，上海师范大学，上海200234；药剂科，绍兴市人民医院，绍兴312000，

摘要：丹参酮是一组广泛用于治疗心血管疾病的活性的二萜类化合物。在这里,我们报告的基因编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），1-deoxy D-木酮糖-5 -磷酸合成酶（DXS）和香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）是利用农杆菌介导的基因转移技术导入丹参毛状根来参与丹参酮生物合成途径的关键酶。较对照组（plt;0.05）而言，在转基因毛状根中SmGGPPS和SmHMGR以及SmDXS的过度表达能显著提高丹参酮的含量。在丹参酮生产中，SmDXS比SmHMGR显示了更强大的推动作用，而SmGGPPS则在刺激丹参酮的积累方面比上游酶SmHMGR或smdxs中更为重要。当SmHMGR和SmGGPPS共表达时，丹参酮产量达到最高（2.727 mg/g DW），比对照组（0.475 mg/g DW）高了约4.74倍（在单克隆HG9中）。且所有被测试的转基因毛状根均比对照组表现出更高的抗氧化活性。据了解，这是在毛状根代谢工程中能增加丹参酮含量同时提高抗氧化活性的的第一份报告。

关键词：丹参；二萜类； 丹参酮；转化；代谢工程

1、引言

丹参（中国丹参）是众所周知的一种中国传统药物。它广泛应用于临床上多种心血管疾病的治疗，如月经紊乱，血液循环平衡紊乱，炎症和心绞痛。

丹参的生物活性成分主要分为两种，即从咖啡酸衍生而来的水溶性酚酸和二萜醌类化合物脂溶性丹参酮。二萜类丹参酮包括丹参酮I，丹参酮IIA，丹参酮IIB ，二氢丹参酮I和隐丹参酮也引起了广泛关注，以及多酚类。丹参酮有多种生物活性。例如，丹参酮I可以增强学习和记忆能力，丹参酮IIA具有抗氧化、抗炎、抗增殖和抗肿瘤特性。二氢丹参酮I、丹参酮IIB和隐丹参酮大但范围的革兰氏阳性细菌具有抗菌活性。因此，丹参被广泛用于生产一些中药制剂。但由于其含量低，生长周期长，质量严重下降，临床应用上对丹参酮的需求日益增加，使其成为研究热点。

农杆菌诱导生成毛状根具有遗传稳定性高、快速、无激素等优点，被认为是一种很有前途的药用植物次生活性成分的生产系统。启发与诱导子如茉莉酮酸甲酯（MJ）,酵母诱导子（YE）和茉莉酸（JA）是提高细胞或毛状根次生代谢化合物的有效途径之一。在丹参毛状根培养中，为提高丹参酮产量，各种诱导因子包括YE，MJ，Ag ，CO 2 ,氨基异丁酸和氨基丁酸（BABA）常被研究试验，近期已被广泛认知且有据可查。植物代谢工程提供了一种不寻常的方式来提高丹参酮的积累，即利用发根农杆菌感染将关键酶转移到丹参中从而参与丹参酮的生物合成途径。在高等植物中，有两个不同的类异戊二烯生物合成途径，分别在不同的细胞区室进行，甲羟戊酸（MVA）途径在细胞溶质中和磷酸化（MEP）途径在质粒体中。异戊烯焦磷酸（IPP），所有的类异戊二烯普遍的前体，可以由MVA和MEP途径合成。作为一种二萜，丹参酮常被认为是通过MEP途径合成的，然而MVA途径也在两个途经的串扰中有一定作用。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A形成MVA（HMG-CoA），已经被确定为MVA途径的关键酶。1-脱氧-D-木酮糖-5 -磷酸合成酶（DXS）催化MEP途径的第一个关键步骤。GGPP合酶（GGPPS）催化二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）与IPP的三分子连续缩合来产生香叶基焦磷酸（GGPP），此为二萜类化合物如丹参酮生物合成普遍的前体。GGPPS被认为是丹参酮生物合成途径中重要的调控目标。

在多个调节点上操纵多个生物合成基因可能是实现相当大的代谢改变的可行策略。这一战略的一个成功的例子是在东莨菪碱生物合成途径工程中通过两个关键酶PMT和H6H的共表达，最终在最好的转基因株系中东莨菪碱产量增加较对照组增加了九倍。最近，丹参中SmHMGR, SmDXR, SmHMGS, SmDXS 和 SmGGPPS已由本实验室成功克隆，这为通过丹参毛状根培养代谢工程从而提高丹参酮收率提供了可能性。在本工作中，我们的报告将含有SmHMGR和/或SmGGPPS以及SmDXS的cDNA在强构性花椰菜花叶病毒的控制下病毒（CaMV）用35S启动子引入丹参细胞。 2、材料和方法 2.1植物表达载体的构建

完整的SmHMGR和SmGGPPS的cDNA从丹参的无菌苗中被克隆在我们实验室之前的报道中。近期，smdxs 的cDNA也被分离出来了。载体pBI121（Clontech）与pCAMBIA1304（CAMBIA）用HindIII和 EcoRI进行双酶切。将纯化的含有GUS报告基因的DNA小片段从pBI121克隆到大pCAMBIA1304片段构建重组质粒pCAMBIA1304 。将SmGGPPS 基因插入到pCAMBIA1304 中通过GUS位点构建新质粒pCAMBIA1304 –SmGGPPS（含SmGGPPS基因）。而将SmHMGR基因通过mGFP5插入到pCAMBIA1304 构建新质粒pCAMBIA1304 -SmHMGR（含SmHMGR基因）。在pCAMBIA1304 -SmHMGR的基础上，将SmGGPPS基因通过GUS位点构建新质粒pCAMBIA1304 -SmHMGR-SmGGPPS含有（SmHMGR 和 SmGGPPS双基因）。在pCAMBIA1304 –SmGGPPS的基础上，将SmDXS基因更换SmGGPPS基因构建新质粒pCAMBIA1304 -SmDXS（含有SmDXS基因）。基因SmHMGR和/或SmGGPPS以及SmDXS 都在花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子强大的控制下。 空白载体pCAMBIA1304 无外源基因（如SmHMGR，SmGGPPS或SmDXS）作为对照组。发根农杆菌菌株C58C1包含Ri质粒pRiA4和上面构建的五个质粒中的一个用于植物遗传转化。

2.2植物转化与发根培养

无菌丹参植物在我们实验室中生长和保存。为了将发根农杆菌菌株C58C1破解和诱导生根，不育叶切片浸入菌悬液30 min，在无菌滤纸上印迹干燥，然后将其放在MS培养基中（含30%蔗糖、0.8%琼脂（pH值5.8）），22℃下暗培养。共培养3天后，用60毫升消毒水水洗处理三次，并在无菌过滤器上吸干。然后转移到1/2MS培养基中（含30%蔗糖，0.8%琼脂（pH值5.8），头孢噻肟钠500毫克/升）。2到3周后，毛状根由无菌叶片生出并快速生长。毛状根（超过2厘米）被切除后单独培养在固体1/2 MS培养基上（含蔗糖30%，琼脂0.8%（ph 5.8），不同浓度头孢噻肟（下一代比上一代浓度递减））3到4周， 25℃下按培养。快速增长毛状根中，具潮霉素抗性且无细菌污染根系进行发根培养。将约200毫克的正常生长的根系接种于250 mL锥形瓶，各瓶含200毫升1/2的MS液体培养基，在轨道摇床100 RPM，25℃下按培养。毛状根克隆进行常规传代培养，每30天和60天后收成。

2.3 DNA分离和PCR分析

用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法从采集的毛状根样品中分离到基因组DNA。然后将此DNA作为PCR分析模板，检测 SmHMGR, SmDXS 和 SmGGPPS基因在转基因毛状根是否存在。据检测，SmGGPPS的上游引物和下游引物分别是：5rsquo;-GAGGACCTAACAGAA -CTCGCC-3rsquo;和5rsquo;-ATGAATCCGACCAGGGATTTG- GAGGGGCAT-3rsquo;。SmHMGR：5-GAGG -ACCTAACAGAACTCGCC-3rsquo;和5rsquo;–GGAAGAGTAG CAGTAGTGCGA-3rsquo;。 PCR在总体积为25 mu;L的反应混合物中进行，含1mu;L各引物，0.5mu;L的10 mmol/L dNTPs，2.5mu;L的10times;PCR buffer (Mg 2 plus), 1mu;L基因组DNA作为模板和1.25个单位的Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。反应体系：.DNA模板在94℃中变性5分钟，接着进行35次循环（94℃为45秒，58℃为60秒，72℃为60秒），在72℃接种持续10分钟。

2.4 RNA分离及基因表达分析

据要求利用RNA准备纯植物试剂盒从毛状根样品中提取总RNA。RNase-free DNase I是用来消化DNA样品的。RNA的质量和浓度按之前所述检查和存储。荧光定量RT-PCR研究了SmHMGR， SmDXS和SmGGPPS基因在转基因毛状根中的表达。对每一个反应，总RNA的等分（0.5mu;g）作为模板来生成总量为30 mu;LRT反应。HMGRKF (5rsquo;-ATGGATAT -CCGCCGGAGGCCA-3rsquo; ) 和HMGRKR (5rsquo;-TCAGGAGCCAATCTTCGTGAT-3rsquo; ), DXSKF(5rsquo;-ATGGCGTCGTCTTGTGGAGTTA-3rsquo;) 和 DXSKR(5rsquo;-TTACAAGTTGTTGAT -GAGATGA-3rsquo;), GGPPSKF(5rsquo;-ATGAGATCTAT-GAATCTGGTG-3rsquo;)和GGPPSKR(5rsquo;-TTAGT -TCTGCCTATGTGCAAT-3rsquo;)用来检测总SmHMGR, SmDXS and GGPPS基因的表达。而HMGRKF和HMGR3rsquo;R (5-CCAATTCTTGACACCAACCAGT-3rsquo;), DXSKF和DXS3rsquo;R (5rsquo;-TACTGCTTCCGCTTCTGGCTT-3rsquo;), GGPPSKF和GGPPS3rsquo;R (5rsquo;-CACCAAACTTTTC -ATTAGCAGC-3rsquo;)仅被用于SmHMGR,SmDXS和SmGGPPS内源性表达的测定。同时，RT-PCR 用18S的上下游引物18SF (5rsquo;-CCAGGTCCAGACATAGTAAG-3rsquo;) and 18SR (5rsquo;-GTACAAAGGGCAGGGACGTA-3rsquo;)作为内参。

2.5高效液相色谱法测定丹参酮的含量

干毛状根（200毫克）用16毫升的甲醇/二氯甲烷（3:1，v／v）粉末和提取，然后在室温下保存24h后，超声处理1h. 提取液在真空下蒸发,用1mL甲醇/二氯甲烷（3:1，v／v）重新溶解。该溶液通过0.22mu; m过滤器进行过滤，并进行高效液相色谱。高效液相色谱法分析了日立L2000装置配备二极管阵列检测器进行，在反相C18柱（5mu;m, 150 mmtimes;4.6 mm管径）上进行分离。柱温为30℃，流动相为乙腈-水（65:35–，v/v）。检测波长为270 nm，流速为1毫升/分钟。注射体积为20mu;m。隐丹参酮（CT），丹参酮I（T1），丹参酮IIA（T2A）通过与标准曲线和保留时间的比较被检测和量化。总丹参酮包含CT,T1和T2A在这报道上被显示为TT。在这里，我们使用光电二极管阵列检测器进行高效液相色谱法研究峰纯度（PDA可以提供紫外-可见扫描数据）。得到的紫外光谱与标准的紫外-可见扫描相同。

2.7统计分析

所有实验包括毛状根克隆培养、PCR鉴定、实时荧光定量PCR、高效液相色谱分析和抗氧化活性测定均重复三次。丹参酮含量结果以平均值plusmn;S.D表示。误差线源于三组生物组。用单样本t检验分析丹参酮差异的统计意义，并用SPSS 11.5软件（SPSS）对不同毛状根克隆的误差进行单因素方差分析。

3、结果

3.1 SmHMGR, SmDXS和SmGGPPS对丹参的转化

含有SmHMGR和/或 SmGGPPS以及SmDXS基因四个质粒由CaMV 35S启动子驱动，分别由发根农杆菌C58C1菌株插入丹参。共有43个 SmHMGR单基因转化系（H线），52个SmDXS单基因转化系（D线），60个 SmGGPPS单基因转化系（G线）和72个SmGGPPS-SmHMGR双基因转化系（hgline）生成。舍弃转基因毛状根在生长中具有异常表型特征的，如短的、棕色的和年老的。39 H, 46 D, 55G 和 67 HG 具有潮霉素抗性且表型正常的毛状根均有待进一步分析。

3.2发根毛状根的PCR分析及发根线的建立

所有独立毛状根的DNA用专为 SmHMGR, SmDXS 或SmGGPPS设计的引物和CaMV 35S启动子进行分离和PCR分析。1304 –SmHMGR, 1304 –SmDXS or1304 –SmGGPPS质粒也进行片段扩增作为阳性对照（PC）。野生型根的DNA作为阴性对照（NC）。另一种由空白向量转换产生的毛根线被表示为BC。PCR阳性克隆总数为41.06%（85/207），H为48.72%（19/39），D为45.65%（21/46），G为23

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