负载姜黄素聚乙二醇化介孔二氧化硅纳米粒子用于光动力治疗的研究外文翻译资料

负载姜黄素聚乙二醇化介孔二氧化硅纳米粒子用于光动力治疗的研究

原文作者 Gaizhen Kuang^a

Qingfei Zhang^cd

Shasha He^b

Ying Liu^a

单位 ^a郑州大学附属肿瘤医院肿瘤内科，中国郑州 450008

^b南洋理工大学化学与生物医学工程学院，新加坡 637457

^c中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室 长春 130022

^d中国科学技术大学 合肥 230026

摘要：姜黄素（Cur）在癌症的光动力疗法（PDT）中可用作光敏剂，但其低生物利用度限制了进一步的临床应用。 一种基于介孔二氧化硅的药物递送系统（PEG化介孔二氧化硅纳米粒子，MSN-PEG@Cur）旨在解决该问题。 MSN-PEG@Cur 的成功制备通过多种物理化学技术进行表征。 逐步详细评估了MSN-PEG@Cur的内吞作用、ROS产生和体外抗癌作用。 结果表明，MSN-PEG@Cur 可以有效地内吞入细胞并释放 Cur，从而在照射时迅速产生 ROS，实现有效的 PDT 治疗癌症。 这种基于 MSN 的药物递送系统为 Cur 负载和癌症的 PDT 提供了一种替代策略。

关键词：MSN；PDT；Cur；癌症；药物输送

一、介绍

最近，无创光动力疗法 (PDT) 被认为是治愈多种癌症的一种很有前景的治疗策略。^1,2 决定 PDT 治疗效果的因素包括光、光敏剂 (PS) 和组织氧。 在 PDT 过程中，PS 被特定波长的光激发，导致产生细胞毒性活性氧 (ROS)，从而诱导癌细胞凋亡或坏死。³ 如今，各种化合物，如染料、药物和化学品等已被广泛应用于光动力学研究中。⁴ 姜黄素 (Cur) 是一种中药，已被证实不仅是一种广谱抗肿瘤药，而且是一种 PS。^5-7 然而，由于其生物利用度低，Cur 目前未用于临床实践。⁸ 为了解决这个问题，可以采用药物递送系统 (DDS) 来负载 Cur，以提高其 PDT 效率。

近年来，各种纳米材料，如脂质体、胶束、聚合物纳米粒子和无机纳米粒子已被广泛设计为癌症治疗领域的 DDS，^9-11可以装载多种药物并通过增强渗透性和的DDSs 修饰目标配体后，EPR 效应介导的被动靶向或主动靶向保留率将它们有效地输送到癌组织。^12,13由于高比表面积、大孔体积和易于化学修饰的优势，介孔二氧化硅纳米粒子 (MSNs) 可以封装/装载大量药物和/或 PS 以实现高药物负载。^14,15此外，由于药物与介孔表面之间的相互作用，如氢键、离子键、静电相互作用和疏水作用， MSN 可以设计为可控的药物递送载体。 ^16-18 利用这些著名的优点，许多多功能 MSN 被设计和开发用于 Cur 递送提高生物利用度并增强 Cur的抗癌作用。¹⁹ Jung 等人开发了介孔二氧化硅基 pH 响应释放系统 (P-MHS)，该系统用邻二氮杂菲功能化并基于“主客体”概念。通过在酸性 pH 条件下 P-MHS 的邻二氮杂菲基团和 Cu² 之间的配位键的裂解，可以有效地控制释放 P-MHS 中的 Cur。²⁰ Karmakar 等人制备了不同电荷的不同介孔二氧化硅纳米粒子以提高 Cur 的生物利用度。因此，负载 Cur 的 MCM-41 纳米颗粒显著增强了对 SCC25 细胞的细胞毒性。²¹ Noorwali 等人合成的多功能 PEG-MSNPs-Cur 可以在酸性肿瘤微环境中进行 pH 触发的 Cur 释放，并用作自发荧光探针。结果表明，PEG-MSNPs-Cur 作为一种有效的化学预防和治疗剂，可显著增强肿瘤生长抑制作用。²² 然而，由 MSNs 加载并充当 PS 的 Cur尚未被充分研究。

在此，我们开发了一种 姜黄素负载 PEGylation（PEG = 聚乙二醇）介孔二氧化硅纳米粒子系统（MSN-PEG@Cur），用于癌症治疗中的有效 PDT（方案 1）。 MSNs表面的聚乙二醇化有助于MSN-PEG@Cur摆脱吞噬作用，导致Cur的溶解度增加和生物利用度提高。^23-25细胞摄取后，Cur可以从MSNPEG@Cur中持续释放，这有利于在辐照时产生足够的 ROS，进一步提高 PDT 的抗肿瘤效率。 这些结果表明，MSNs 是一种有前途的纳米载体，可以为 PDT 加载 Cur。

方案 1 MSN-PEG@Cur的制备过程及MSN-PEG@Cur内吞后胞内PDT过程示意图

二、实验部分

（一）材料

Cur (99%) 购自国药集团化学试剂有限公司。 聚（乙二醇）单甲醚（mPEG2k-OH）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）、琥珀酸酐、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Sigma。 原硅酸四乙酯 (TEOS) 和 N-十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 分别购自阿拉丁和亿利精细化工有限公司。 二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）购自上海碧云天生物有限公司。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）和Hoechst购自Sigma-Aldrich。 宫颈癌细胞系 Hela 购自中国科学院上海生化与细胞生物学研究所。 细胞用 Dulbeccos Modified Eagle 培养基（DMEM，添加 10% 胎牛血清）在含有 5% CO₂ 的湿润气氛中于 37 ℃培养。

（二）测量

¹ H-NMR 光谱通过 Unity-400 MHz NMR 光谱仪 (Bruker) 在 CDCl₃ 中测量。傅里叶变换红外分光光度计 (FT-IR) 测量记录在 Bruker Vertex70 Win-IR 仪器上。使用场发射扫描电子显微镜（SEM，来自 Micro FEI Philips 的 Model XL 30 ESEM FEG）观察颗粒。在加速电压为 100 kV 的 JEM-1011 电子显微镜上进行透射电子显微镜 (TEM) 研究。粒度在 Malvern Zetasizer Nano ZS 上进行。 N2 吸附-解吸等温线在 Micromeritics ASAP 2020M 自动吸附分析仪上记录。样品在 150 ℃ 下脱气 5 小时。使用Brunauer-Emmett-Teller（BET）模型从低压范围内的吸附数据计算比表面积，并根据Barrett-Joyner-Halemda（BJH）方法确定孔径。使用紫外-可见分光光度计（UV-2450PC，Shimadzu）测定紫外（UV）光谱。共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 图像由蔡司 710 共焦激光扫描显微镜成像系统 (日本) 可视化。

MSN-NH₂ 和 MSN-PEG 的合成。根据参考程序合成胺化 MSN (MSN-NH₂)。简而言之，首先通过超声将 CTAB (1.0 g) 溶解在蒸馏水 (500 mL) 中。将 NaOH 溶液 (3.5 mL, 2.00 M) 添加到上述 CTAB 溶液中，然后在剧烈搅拌下加热至 80℃。然后将 TEOS (5.0 mL) 缓慢滴入混合液中，并在 80℃下保持 2 小时。通过离心（9000 rpm，10 分钟）分离沉淀，用去离子水和乙醇逐步洗涤，然后真空干燥。将获得的白色粉末 MSN (1.6 g) 和 APTES (1.0 mL) 加入无水甲苯 (100 mL) 中，并在 90℃ 在氮气下搅拌 24 h。然后，通过离心收集产物并用甲苯、丙酮和乙醇洗涤。将粗产物分散在含有甲醇 (160 mL) 和 HCl (10 mL, 37.4%) 的溶液中，并在 80 ℃ 下回流 12 小时以消除 CTAB。产物经离心纯化后用乙醇洗涤3次，记为MSN-NH2。

mPEG_2k-OH 用琥珀酸酐修饰，制备的化合物名为 mPEG_2k-COOH。 简而言之，将 mPEG_2k-OH（2.0 g，1.0 mmol）与琥珀酸酐（400 mg，4.0 mmol）在甲苯（20 mL）中的溶液在 65 ℃ 下搅拌 24 小时。 通过真空蒸馏除去甲苯后，加入二氯甲烷(5mL)并将溶液滴入过量的乙醚中。 将沉淀分离并重新溶解在二氯甲烷中，再沉淀两次，最后真空干燥得到mPEG2k-COOH的白色粉末。

将 MSN-NH₂ (1.6 g)、mPEG_2k-COOH (8.0 g, 4 mmol)、EDC·HCl(764 mg, 4 mmol) 和 NHS (460 mg, 4 mmol) 溶解在干燥的 DMSO 中并在 室温下搅拌48小时。 通过离心收集聚乙二醇化的 MSN（MSN-PEG），用水洗涤并真空干燥过夜。

Cur 负载和释放。 Cur (10 mg) 和 MSN-PEG (100 mg) 通过超声溶解在 DMSO (5 mL) 中。 将液体在室温下搅拌 24 小时并离心（12 000 转/分，15 分钟）。 用乙醇反复洗涤所得沉积物，然后真空干燥。 这些粒子被命名为 MSN-PEG@Cur。 通过紫外-可见分光光度计测量载药颗粒中Cur的载药量（DLC）和载药效率（DLE）。 加载的 Cur 用 DMF 提取。 离心除去颗粒后，收集上清液，用紫外-可见分光光度计在425 nm波长处测量。 DLC 和 DLE 可通过以下等式进一步计算：

DLC (%) =（颗粒的当前重量/颗粒的总重量）x100%

DLE (%) =（以颗粒计的 Cur 重量/Cur 的初始进料量）x 100%

将 MSN-PEG@Cur（2.0 毫克）溶解在 1.0 毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）或醋酸缓冲溶液（ABS，pH 5.0）中。 透析袋（MWCO = 3500）用于放置上述溶液，然后浸入相应的缓冲溶液（19 mL）中。 释放介质在恒温振荡器中于 37 ℃温育。 在预定时间，取出透析袋外 1 mL 缓冲液进行 UV-Vis 测量，并更换为相同体积的缓冲液。 借助相同缓冲液中 Cur 的校准曲线，从 425 nm 处的吸光度确定 Cur 的释放量。

细胞摄取。 MSN-PEG@Cur 的内吞作用和细胞内药物释放通过 CLSM 进行测量。 Hela 细胞接种在 6 孔培养板中（每孔 5 x 104 个细胞）并培养 24 小时。 然后将细胞与 MSN-PEG@Cur 或最终 Cur 浓度为 3.0 mu;g mL^-1 的游离 Cur 在 37℃下孵育 0.5 小时或 4 小时。 除去培养基，用PBS洗涤细胞并用4%甲醛在室温下固定30分钟。 用 Hoechst 染色细胞核后，将载玻片安装并通过 CLSM 观察。

ROS的检测。 为了评估游离 Cur 和 MSN-PEG@Cur 的 ROS 生成能力，采用了一种使用吲哚青绿 (ICG) 作为活性氧指示剂的化学方法，并通过紫外-可见光谱进行监测。 将等量的游离 Cur（5 mu;g mL^-1）和 MSN-PEG@Cur（Cur 浓度为 5 mu;g mL^-1）与 ICG 溶液（10 mu;g mL^-1）混合，然后用 430 nm 的光照射 20 mW cm^-2 对于不同的时间间隔。 为了增加 Cur 在水中的溶解度，首先将 Cur 溶解在 DMSO 中，然后将其添加到含有 ICG 的水溶液中。 检测ICG的吸收强度。 研究 MSN-PEG@Cur 和 ICG 的混合溶液与醋酸盐缓冲溶液（ABS，pH 5.0）在恒温摇床中于 37 ℃ 孵育 4 小时，以和不含 Cur 释放的 MSN-PEG@Cur 的 ROS 生成能力比较。

DCF-DA（细胞活性氧检测试剂盒）检测细胞内ROS。 Hela 细胞接种在 6 孔板中（每孔 5 x 104 个细胞）并培养 24 小时。 然后将细胞与 MSN-PEG@Cur 或游离 Cur 以最终 Cur 浓度3.0 mu;g mL^-1，在 37 ℃下在黑暗中孵育 4 小时。 将培养基更换为 DMEM（1 mL，包括 1 mL DCF-DA）并再孵育 30 分钟。 用PBS洗涤后，CLSM观察细胞。 与未照射组相比，照射组在更换含有 DCF-DA 的 DMEM 前暴露于光照（430 nm，20 mW cm^-2）30 分钟。

细胞毒性。 抗癌活性通过针对 Hela 细胞的 MTT 测定获得。 将细胞接种到 96 孔板中（每孔 5 x 103 个细胞）并培养 24 小时。 MSN-PEG@Cur 或游离 Cur 的最终梯度

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