β-榄香烯和西妥昔单抗联合治疗通过诱导铁死亡和抑制上皮间质转化对 KRAS 突变的结直肠癌细胞敏感外文翻译资料

beta;-榄香烯和西妥昔单抗联合治疗通过诱导铁死亡和抑制上皮间质转化对 KRAS 突变的结直肠癌细胞敏感

原文作者 ：Peng Chen1, 2, 3*, Xuejie Li4*, Ruonan Zhang2, 3, Shuiping Liu2, 3, Yu Xiang2, 3, Mingming Zhang2, 3, Xiaying Chen2, 3, Ting Pan2, 3, Lili Yan2, 3, Jiao Feng2, 3, Ting Duan2, 3, Da Wang6, Bi Chen2, 3, Ting Jin2, 3, Wengang Wang2, 3, Liuxi Chen2, 3, Xingxing Huang2, 3, Wenzheng Zhang2, 3, Yitian Sun2, 3, Guohua Li2, 3, Lingpan Kong2, 3, Xiaohui Chen5, Yongqiang Li2, 3, Zuyi Yang5, Qin Zhang2, 3, Lvjia Zhuo2, 3, Xinbing Sui2, 3, Tian Xie1, 2, 3

单位：1. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

2. Holistic Integrative Pharmacy Institutes and Department of Medical Oncology, The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, College of Medicine, Hangzhou Normal University, Hangzhou, Zhejiang, China

3. Key Laboratory of Elemene Class Anti-cancer Chinese Medicine of Zhejiang Province, Hangzhou Normal University, Hangzhou, Zhejiang, China

4. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Medical School of Zhejiang University, Hangzhou, China

5. Department of Hematology and Oncology, the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, College of Medicine, Hangzhou Normal University, Hangzhou, Zhejiang, China

6. Department of Colorectal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, Chin

摘要：背景和目的：RAS 突变限制了抗表皮生长因子受体的有效性

(EGFR) 单克隆抗体联合化疗治疗转移性结直肠癌 (mCRC) 患者。因此，新的细胞死亡形式集中在确定抑制 Ras 诱导的肿瘤发生的间接靶点。最近，新出现的证据表明，在癌症治疗中可能会触发铁死亡，尤其是在根除对传统疗法有抵抗力的侵袭性恶性肿瘤方面。

方法：用西妥昔单抗和beta;-榄香烯处理KRAS突变CRC细胞HCT116和Lovo，beta;-榄香烯是一种从中药莪术中分离的生物活性化合物。在体外和体内检测到铁死亡和上皮间质转化 (EMT) 。建立原位CRC动物模型并通过IVIS生物发光成像监测肿瘤生长。收集肿瘤组织以确定治疗后铁死亡效应和EMT标志物的表达。

结果：CCK-8实验表明，125 mu;g/ml beta;-榄香烯与25 mu;g/ml西妥昔单抗在KRAS突变的CRC细胞中具有协同作用。AV/PI 染色表明在用beta;-榄香烯和西妥昔单抗治疗后细胞死亡的非凋亡模式。在体外，beta;-榄香烯与西妥昔单抗联用可诱导铁依赖性活性氧 (ROS) 积累、谷胱甘肽 (GSH) 耗竭、脂质过氧化、HO-1 和转铁蛋白的上调以及铁死亡的负调节蛋白的下调（GPX4、SLC7A11、FTH1、谷氨酰胺酶和 SLC40A1）在 KRAS 突变的 CRC 细胞中。同时，联合治疗beta;-榄香烯和西妥昔单抗抑制细胞迁移并降低间充质标志物（波形蛋白、N-钙粘蛋白、Slug、Snail 和 MMP-9）的表达，但促进上皮标志物 E-钙粘蛋白的表达。此外，铁死亡抑制剂不是其他细胞死亡抑制剂消除了beta;-榄香烯与西妥昔单抗联合对 KRAS 突变 CRC 细胞的影响。在体内，beta;-榄香烯和西妥昔单抗的联合治疗抑制了 KRAS 突变的肿瘤生长和淋巴结转移。

结论：我们的数据首次表明天然产物beta;-榄香烯是一种新的铁死亡诱导剂，beta;-榄香烯和西妥昔单抗联合治疗通过诱导铁死亡和抑制EMT对KRAS突变CRC细胞敏感，有望提供一个前瞻性的研究,给予 RAS 突变 CRC 患者的治疗策略。

关键词：beta;-榄香烯, KRAS 突变, 结直肠癌, 铁死亡, 上皮间质转化

介绍

结直肠癌 (CRC) 是全球第三大最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的第二大常见原因 ¹。尽管最近在诊断和治疗策略方面取得了进展，但由于对抗癌治疗和疾病进展的抵抗力，CRC 仍然是最致命的人类癌症之一。

近年来，转移性结直肠癌（mCRC）的治疗取得了进展，主要是针对表皮生长因子受体（EGFR）或血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体联合化疗。已推荐抗EGFR抗体，如西妥昔单抗或帕尼单抗，联合化疗是仅对RAS野生型mCRC患者有效的治疗方法²。然而，由于下游 KRAS 突变，它们的有效性通常受到内在耐药性的限制。大约 50% 的 CRC 中存在 RAS 突变，它们极大地阻碍了 EGFR 抑制剂的治疗效果 ³。因此，迫切需要基于 RAS 突变的间接靶点开发新的细胞死亡形式。

铁死亡是一种新发现的细胞死亡形式，其特征是致死脂质过氧化的铁依赖性积累^4-5。众所周知，铁死亡在遗传、生化和形态学水平上不同于细胞凋亡、坏死和自噬⁶。迄今为止，新出现的证据表明，在癌症治疗中可能会触发铁死亡，尤其是在根除对传统疗法具有抗性的侵袭性恶性肿瘤方面⁷。最近，有趣的是，与非耐药癌细胞相比，那些通常经历上皮间充质转化 (EMT) 的耐药癌细胞更容易被铁死亡诱导剂杀死 ^8-10。所以归纳诱导铁死亡已成为一种治疗策略治疗耐药癌症引发癌细胞死亡。

beta;-榄香烯，一种从中药姜黄提取的生物活性化合物, 表现出广谱抗癌作用，并用于各种癌症类型，包括 CRC ^11-12。然而，尚未报道其在铁死亡中的作用以及 KRAS 突变的 CRC 细胞对西妥昔单抗治疗的敏感性。在这里，我们首次证明了beta;-榄香烯和西妥昔单抗的联合治疗在 KRAS 突变的 CRC 细胞 HCT116 中诱导了铁死亡细胞死亡，伴随着这些癌细胞中细胞活力的降低和脂质过氧化的铁依赖性积累增加。提供促凋亡救援剂，但不提供泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，自噬抑制剂或坏死性下垂抑制剂消除了beta;-榄香烯和西妥昔单抗治疗诱导的细胞死亡，表明铁死亡导致了beta;-榄香烯与西妥昔单抗联合治疗引起的细胞死亡。同时，我们表明，beta;-榄香烯和西妥昔单抗的联合治疗可以通过抑制 EMT 来抑制 KRAS 突变的 CRC 细胞的迁移。总之，我们的数据表明天然产物beta;-榄香烯是一种新的铁死亡诱导剂，beta;-榄香烯和西妥昔单抗的联合治疗通过诱导铁死亡和抑制EMT对KRAS突变的CRC细胞敏感，这有望为CRC提供一个前瞻性的策略为RAS 突变患者。

材料和方法

细胞系：

人结肠癌细胞系 HCT116、Lovo 和 CaCO2 购自 ATCC（LGC 标准 SLU，巴塞罗那，西班牙）。将细胞系维持在含有 10% 胎牛血清 (FBS)、100 单位/ml 青霉素、100 mu;g/ml 链霉素 (Invitrogen) 的 McCoy 5A 培养基 (#GR16600-S) 和 DMEM/F12 (#GR12400-S) 中，和 2 mM L-谷氨酰胺，温度为 37 ℃，在 95% 空气和 5% CO ₂的加湿气氛中。胎牛血清购自 Corille (184590, Australia)。

试剂和抗体：

beta;-榄香烯 (gt;98%) (#E4418) 购自 LKT。在乙醇中制备 100 mg/ml 的储备溶液并储存在 -4°C。西妥昔单抗 (#33657) 购自 MCE。针对 GPX4 的抗体 (#GR 251529-34)、HO-1 (#GR3187585-3)、谷氨酰胺酶 (#GR 3299063-1)、SLC40A1 (#GR215168-39)、转铁蛋白 (#GR3207592-9)、SLC76G7135 -6) 购自 Abcam。N-Cadherin (#13116S)、E-Cadherin (#14472S)、MMP9 (#13667S)、snail (#3879T)、slug (#9585T) 和 GAPDH (#2118S) 抗体均来自 Cell Signaling Technology。波形蛋白 (#SA10106DB) 购自 ABGENT。Ki67 (#66434-1-Ig) 购自 Proteintech。去铁胺 (#CS-4479)、Ferrostain-1 (#HY-100579)、Necrostain-1 (#HY-15760) 购自 MCE。Z-VAD-FMK (#V116) 购自 Sigma Aldrich。Liproxstatin-1 (#S7699) 和 RSL3 (#S8155) 购自 Selleck Chemical。

细胞活力和细胞死亡百分百的测量

根据制造商的说明，使用 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (LJ621, DOJINDO, JAPAN) 评估细胞活力。将细胞以每孔 5000 个细胞的密度接种在 96 孔平底微量滴定板中。在酶标仪（Synergy HT，Bio-Tek，美国）上在 450 nm 处测量吸光度。Pharmingen Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 I（BD，美国）用于检测细胞死亡百分比，并根据制造商的说明进行估计程序。2times;10 ⁶将细胞接种到 6 cm 培养皿中。贴壁过夜后，用 PBS 洗涤细胞两次，并用不同的药物更换培养基 24 小时。收获所有细胞，包括培养基中的漂浮细胞。将细胞以1times;10 ⁶细胞/ml的浓度重新悬浮在冰冷的1times;结合缓冲液中。100 mu;l 细胞悬液各与 5 mu;l FITC Annexin V 和 5 mu;l PI 混合。将混合物在室温下避光孵育 15 分钟，然后通过 FACS Calibur 流式细胞仪（Beckman Coulter，CytoFLEX S）进行分析。

细胞周期分析：

将密度为 5times;10 ⁵ /ml 的细胞接种在 6 cm 培养皿中，然后用 beta;-榄香烯、西妥昔单抗和它们的组合处理 24 小时。处理后，收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，然后用购自 Becton, Dickinson and Company 的细胞周期染色试剂盒（#A90524）在室温下在暗室中染色 30 分钟。通过 FACS Calibur 流式细胞仪 (Beckman Coulter, CytoFLEX S) 分析细胞周期分析。

Transwell 和伤口愈合实验

对于 transwell 迁移，将 1times;10 ⁵ /ml 细胞悬浮在 200 mu;l 含有 0.1% 牛血清白蛋白的培养基中，进入 24 孔 transwell 板（8 mu;m 孔径；Corning）的上室，以及 500 mu;l 含有 10% FBS 的培养基被添加到下室。共培养24 h后，膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。然后在尼康光学显微镜（尼康公司）下对染色的细胞进行计数。捕获在 200 倍放大率下跨越三个重复孔的随机照片用于分析。thinsp;thinsp;thinsp;thinsp;

对于伤口愈合试验，用无菌塑料尖端以 95% 的汇合率划伤单层细胞，用 PBS 洗涤 3 次，然后用无血清培养基培养 24小时。在尼康光学显微镜（尼康公司）下捕获跨越三个重复孔的随机场的照片用于分析。thinsp;

集落形成分析

对于单层培养的集落形成测定，将细胞（1times;10 ³ /孔）接种在10cm培养皿中两周。甲醇固定后

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[598110]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word