Rb通过HDAC1和HDAC8增强IFN-β 启动子的去乙酰化选择性抑制先天性IFN-β的产生外文翻译资料

Rb通过HDAC1和HDAC8增强IFN-beta;

启动子的去乙酰化选择性抑制先天性IFN-beta;的产生

摘要

I型IFN的产生受宿主严格控制，从而有效的清除病毒，而无有害的免疫病理学或诱导自身免疫性疾病。先天免疫和炎症性疾病中I型IFN产生的表观遗传调控仍有待完全弄清楚。几种肿瘤抑制剂已被证明可以调节免疫反应和炎症。然而，肿瘤抑制因子在先天免疫和炎症性疾病中的非经典功能需要进一步鉴定。在这里我们报告缺乏视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）可选择性增强TLR和病毒触发的IFN-beta;产生，从而在先天刺激的后期诱导更多IFN-alpha;的生成，但对TNF，IL- 6和巨噬细胞中的早期IFN-alpha;的产生没有影响。Rb1fl/flLyz2creb，Rb缺陷小鼠表现出更强的抗致死病毒感染能力和更有效的流感病毒清除。 Rb通过与c-Jun（IFN-beta;增强体的组分）相互作用选择性地结合Ifnb1增强子区域，但不结合Ifna4，Tnf和Il6的启动子。然后Rb募集HDAC1和HDAC8以减弱Ifnb1启动子中组蛋白H3 / H4的乙酰化，从而抑制Ifnb1转录。因此，Rb通过增强Ifnb1启动子的去乙酰化选择性地抑制先天性IFN-beta;的产生，在先天免疫中表现出先前未知的非经典作用，这也表明Rb在调节炎症或自身免疫疾病中I型IFN产生中的作用。

关键词：视网膜母细胞瘤蛋白 固有免疫 IFN-beta; 组蛋白去乙酰化 炎症

1. 介绍

肿瘤抑制因子是多种细胞应激形式的传感器，如DNA损伤，传统上称为细胞周期，细胞凋亡和致癌作用的调节因子。由于肿瘤抑制因子参与由慢性感染和炎症引起的某些类型的癌症的癌发生，因此它们也可能与炎症过程有关。事实上，越来越多的证据表明，肿瘤抑制因子不仅在控制肿瘤发展和进展中发挥作用，而且在与癌症相关的炎症和先天免疫反应中发挥作用。例如，p53突变体可以增加和延长NF-kappa;B活性并加剧小鼠的慢性结肠炎，导致发生侵袭性结肠癌的高风险^[1]。此外，p53可直接抑制Il4，Il6和Il12的转录，而p53缺陷型小鼠易患自身免疫性疾病，提示p53可抑制自身免疫性炎症^[2]。然而作为第一个肿瘤抑制因子，视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），是否在先天免疫反应中发挥作用仍然未知。

当模式识别受体（PRR）检测到病毒入侵时，I型干扰素（IFN）作为抵抗病毒的关键先天防御元素迅速产生，以激活抗病毒固有免疫，PRR包括Toll样受体（TLR），视黄酸 - 诱导型基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和细胞溶质DNA传感器^[3-5]。 PRR感知病毒感染后通过不同的信号通路激活TANK结合激酶1（TBK1）和kappaB激酶epsilon（IKKε）抑制剂，导致干扰素调节因子3（IRF3）和IRF7的磷酸化和核转位。然后这两个IRF与Ifna和Ifnb1基因的启动子结合，并引发这些基因的转录^[6]。I型IFN产生不足导致病毒的清除不足并导致持续的病毒感染，而过量的I型IFN产生可能对宿主有害并引起炎症或自身免疫疾病^[7,8]。因此，I型IFN产生受宿主严格控制，以产生有效的病毒清除而无有害的免疫病理学。从用于病毒识别的受体到信号衔接子，激酶和负责IFN产生的转录因子过程均可调节I型IFN的产生^[8-12]。而且，越来越多的注意力集中到转录水平上对I型IFN产生的调节^[13-15]。然而，I型IFN产生的转录调节，特别是通过表观遗传修饰，仍有待完全弄清楚。

Rb是一种肿瘤抑制因子，参与许多不同的细胞过程，包括控制细胞发育和分化，调节细胞凋亡和自噬，以及维持染色体稳定性^[16]。在免疫系统中，Rb可以促进胸腺退化并抑制T细胞增殖^[17]。一些研究表明，在DNA或RNA病毒感染相关的癌症起源和发展过程中，Rb经常被病毒蛋白靶向^[18]。由人乳头瘤病毒表达的病毒癌蛋白E7可以减弱Rb的生长抑制特性，从而刺激病毒感染细胞的细胞增殖和抗凋亡^[18]。此外，病毒感染通常随着肿瘤抑制因子的变化诱导宿主细胞的应激反应，并且由病毒感染诱导的未解决的炎症中可能有助于癌发生。因此，我们想知道Rb是否直接参与固有免疫和炎症。实际上，越来越多的证据表明Rb1基因表达在病毒和细菌感染的反应中被上调（GSE675，GSE13395，GSE13670）^[19-21]并且Rb1 表达也显示一些自身免疫性疾病如类风湿性关节炎（RA）和多发性硬化症（MS）（GSE10500，GSE16032，GSE38010）^[22-24]的显着变化。但是，这种作用和 Rb在固有免疫和炎症性疾病中的潜在机制仍然在很大程度上是未知的。 在此，我们报道Rb缺乏可以通过在早期选择性地产生更多的IFN-并在后期诱导更多的I型IFN来保护小鼠免受RNA和DNA病毒感染。我们的研究证明了通过先天性免疫反应中的表观遗传修饰来抑制肿瘤抑制因子Rb产生IFN-beta;的新途径。

1. 材料和方法

2.1老鼠

Rb1 ^{fl / fl}小鼠（B6; 129-Rb1^tm3Tyj / J），LysMcre小鼠（B6; 129P2-Lyzs^{tm1（cre）Ifo} / J）和IfnabR ^{- / -} 小鼠（B6.129S2-Ifnar1^t-m1Agt / Mmjax）是从杰克逊实验室获得，并在特定的无病原体条件下繁殖; 6至8周龄的同窝小鼠用于实验（体重和性别相同。）所有动物实验均按照国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并经上海第二军医大学科学研究委员会批准。

2.2试剂和抗体

LPS（大肠杆菌血清型0111：B4），CpG-ODN和Poly（I：C）来自Sigma-Aldrich，其已在先前描述[25]。 Rb的抗体来自Cell Signaling Technology。对乙酰基- 组蛋白H3和乙酰 - 组蛋白H4的抗体来自Millipore。组蛋白去乙酰化酶抗体HDAC1和HADC2来自Abcam，HDAC3来自Cell Signaling Technology，HDAC8来自Epigentek。 Lamin A / C，GAPDH，b-actin，c-Jun，ATF-2，IRF3抗体和针对ERK（Thr202 / Tyr204），JNK（Thr183 / Tyr185），p65（Ser536）和IRF-3的磷酸化特异性抗体 （Ser396）来自Cell Signaling Technology。

2.3细胞培养和病原体

HEK293T和RAW264.7细胞系获自American Type Culture Collection。巯基乙酸盐（Merck）引发小鼠腹膜巨噬细胞，如前所述制备骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）[25]。 VSV（印第安纳株）通过感染单层HEK293T细胞进行繁殖和扩增。感染后24小时，将细胞解冻并重新冷冻，然后通过离心分离并收集含有病毒的上清液。通过TCID50在HEK293T细胞上测定病毒滴度。在流感病毒株A / Puerto Rico / 8/1911 H1N1（PR8）（由浙江大学医学院H. Yao博士提供，中国杭州）在8至10日龄的含胚鸡蛋中繁殖。仙台病毒（由中国科学院上海生命科学研究院孙斌博士亲情提供）和HSV-1病毒（中国中国医学科学院李启汉博士友情提供的Kos株）按指示获得。

2.4质粒构建和转染

编码小鼠Rb1的重组载体（GenBank登录号NM_009029.2）从小鼠腹膜巨噬细胞的cDNA扩增，然后克隆到pcDNA3.1载体（Invitrogen）中。将Ifnb1的启动子和Ifnb1启动子的截短物克隆到PGL3-增强荧光素酶载体（Promega）中以构建启动子荧光素酶报告载体，如前所述^[25]。所有构建体均通过测序确认。按照制造商的说明，用jetPEI试剂（Polyplus Transfection）将质粒瞬时转染到HEK293T细胞中。

2.5 RNA干扰

制备小鼠原代腹膜巨噬细胞并如上所述培养过夜，然后在干扰前将培养基更换为新鲜培养基。如制造商说明书中所述，使用INTERFERin试剂（Polyplus Transfection）用siRNA转染细胞。特异于小鼠Rb1的siRNA序列是50-GGAGUUUGAUUCCAUUAUA-30和50-GCAUAUCUCCGACUAAAUA-30。针对小鼠c-Jun的siRNA特异性序列是c-Jun-1 50 -GUGCCUACGGCUACAGUAA-30或c-Jun-2 50-CAGCUUCCUGCCUUUGUAA-30。小鼠Hdac1和Hdac8的siRNA特异性序列分别为50-AGUGCUGUGAAGCUUAAUA-30和50-CGGCAAGUGUCUGAAGUAU-30对照siRNA的序列为50-UUCUCCGAACGUGUCACGU-30。这些siRNA由GenePharma Co.（中国上海）或Thermo Scienti fi c设计和合成。 48小时后，收获细胞或培养物上清液用于ELISA测定，实时PCR分析，Western印迹或ChIP测定。

2.6慢病毒转导

对于慢病毒转导，将小鼠原代腹膜巨噬细胞（2times;10^5 /well）在24孔板中培养过夜。巨噬细胞用在Polybrene（GENECHEM CO.Shanghai）中稀释的Rb（MOI 25）或对照EGFP（MOI 25）慢病毒感染。 8-12小时后，将培养基更换为含有10％（体积/体积）胎牛血清的新鲜DMEM培养基。分析GFP在细胞中的表达，每24小时确认一次过表达效率。裂解细胞以收获RNA并处理用于实时PCR分析。

2.7 RNA定量

用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总细胞或组织RNA。按照说明使用First Strand cDNA Synthesis试剂盒（Toyobo）进行逆转录。如前所述，使用lightCycler（Roche）和SYBR Quantitative real-time PCR kit（Takara）进行Q-PCR^[25]。用于Rb1引物的是5-TGACCTGGTAATCTCATTT-CAGC-3（有义）和5-GGGTGTTCGAGGTGAACCAT-3（反义）。 Tnf，Il6，Ifnb1，Ifna4，PR8 HA，PR8 M1，PR8 PA和b-肌动蛋白引物与先前报道的相同^[11,26]。将数据标准化为b-肌动蛋白表达。

2.8荧光素酶报告基因测定

用荧光素酶报告质粒，pRL-TK-Renilla-荧光素酶质粒和如上下文所示的其他载体共转染HEK293T或RAW264.7细胞。用空对照载体平衡质粒DNA的总量。 24-48小时后，收集细胞并用Passive Lysis Buffer（Promega）孵育20-30分钟，然后将细胞裂解物转移到新板中进行检测。根据制造商的说明，使用Dual Luciferase Reporter Assay System（Promega）测量荧光素酶活性。通过将萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性分开，将数据标准化为转染效率。

2.9免疫沉淀和免疫印迹分析

用细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technology）和另外的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Calbiochem）和1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）提取细胞的总蛋白。用NE-PER提取试剂（Thermo）提取细胞质和核蛋白。在用二辛可宁酸测定法BCA（Pierce）测量浓度后，计数等量的蛋白质用于蛋白质印迹或免疫沉淀，如所述^[11]。

2.10肺组织学

解剖对照或病毒感染的小鼠的肺，将其固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，切片，用苏木精和伊红溶液染色，并通过光学显微镜检查组织学变化。

2.11 Ch

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