联用超高效液相色谱-串联质谱法结合基质固相分散萃取法测定木贼中的酚类化合物外文翻译资料

联用超高效液相色谱-串联质谱法结合基质固相分散萃取法测定木贼中的酚类化合物

原文作者：Zuofu Wei ，Youzhi Pan ，Lu Li ，Yuyang Huang ，Xiaolin Qi ，Meng Luo ，Yuangang Zu ，Yujie Fu

摘要:提出了一种基于基质固相分散萃取和超高效液相色谱-串联质谱法从木贼中提取酚类化合物和测定的方法。该方法结合了基质固相分散萃取的高效率和超高效液相色谱与串联质谱的快速性、灵敏度和准确性的优点。研究并优化了基质固相分散萃取的影响参数。优化条件如下：选择硅胶作为分散吸附剂，选择硅胶与样品的比例为2∶1(400/200 mg)，并使用8 mL 80 %甲醇作为洗脱溶剂。此外，建立了一种快速、灵敏的超高效液相色谱-串联质谱法测定木贼中9种酚类化合物的方法。该方法在小于6分钟的时间内完成，具有良好的线性、精密度和回收率。与超声辅助提取相比，基质固相分散法具有更高的提取效率，并且更方便和省时，减少了对样品和溶剂量的要求。这些结果表明，我们所开发的方法是提取和测定植物基质中活性成分的一种极好的替代方法。

关键词：木贼；质谱；基质固相分散体；酚类化合物；超高效液相色谱法

1. 简介

木贼(木贼科，木贼亚属)，也叫马尾巴或驼背，是广泛分布在北半球潮湿或沼泽地区的蕨类植物。它的地上部分被用作治疗消化性溃疡和痔疮的传统草药，并用于肾结石的治疗[1,2]。药理研究表明，木贼具有多种生物活性，包括保护胃的作用、遗传毒性、抗氧化和抗微生物活性[3-5]。化学研究表明，黄酮类化合物是导致其有益生物活性的主要化合物[5-7]。在我们之前的植物化学研究中，四种黄酮苷(槲皮素-3- O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷(QG)，芹菜素-5-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷(AG), 芫花黄素-5-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷(GG)和木犀草素-7-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷(LG))、三种黄酮苷元(木犀草素(LU)、芹菜素(AP)和芫花黄素(GE))以及一种有机酸(4-O-(对香豆酰基)莽草酸(SA))，首次从该植物中分离出来，并对其结构进行了表征。

QC分析是安全有效使用草药的一个重要方法。然而，最大的挑战之一是草药固有的复杂性。据我们所知，目前还缺乏一种可以提供快速测定木贼活性成分全面信息的方法。气体色谱法[8]和高效液相色谱-紫外检测法[9]已被用于分析木贼的成分。然而，这些方法是不够的，因为它们仅用于分析精油和三种黄酮苷元。最近，液相色谱-质谱联用技术广泛应用于独立评估目标化合物的保留时间和质量，而不受样品中杂质的干扰[10，11]。超高效液相色谱作为分离科学界的一个新趋势，与传统的高效液相色谱仪器相比，具有突出的优势。超高效液相色谱在高压(高达10⁸Pa )下进行，色谱柱填充有亚-2mu;m的粒子，增加了传质，减少涡流扩散谱带展宽的影响[12]。产生了更高的分辨率和效率，这在分离复杂混合物时尤为重要，而且分析时间短，增加了样品处理量[13]。

提取一直是进一步利用和分析植物基质中活性成分的关键步骤，通常需要破坏一般基质的结构。传统的提取方法通常耗时且效率低下，而且需要大量的溶剂和样品。基质固相分散萃取(MSPD)作为一种有吸引力的替代方法，最近被引入到复杂生物制剂的样品制备中。它基于原料和分散吸附剂的机械混合。在该方法中，分散吸附剂既作为研磨剂又作为“结合”溶剂，破坏原料的结构，分散其组分，并促进它们和分析物之间更有效的相互作用。该材料分散在所用分散吸附剂的表面上，产生用于提取目标化合物的独特混合特征相[14]。该方法在样品制备中具有许多优点，例如较高的简单性、灵活性和多功能性、低成本、快速性、温和的提取条件(室温和大气压)，以及非常少的有机溶剂消耗[15-17]。此外，使用MSPD，可以在一个步骤中对一小部分样品进行提取和净化(如果需要的话)。因此，MSPD萃取被认为是浸渍萃取、回流萃取、超声辅助提取技术（UAE）等的有效替代方法。然而，MSPD用于提取植物基质中的成分的报道很少[14,18,19]。

在本研究中，我们旨在开发一种将MSPD和UHPLC-MS/MS相结合的分析方法，用于同时定量分析木贼中的九种酚类化合物。为了提高产率，我们考察了MSPD提取参数，如分散吸附剂、分散比、吸附剂与样品、洗脱溶剂及其体积。据我们所知，还没有研究能够提供更全面的关于木贼活性成分测定的信息。

图 1所研究的酚类化合物的化学结构，谷氨酸：吡喃葡萄糖苷

1. 材料和方法

2.1 试剂和材料

在我们的实验室中，山奈酚-3-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷-7-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷(KGG)、QG、AG、GG、LG、LU、AP、GE和SA从木贼中分离和纯化。与文献数据[20-31]相比，它们的结构(图1)通过ESI-MS、¹H NMR和¹³C NMR光谱得到证实。HPLC级甲醇和甲酸分别从Jamp;K化工公司(中国北京)和Dikma Technologion公司(美国密歇根州马斯科根)购买。所有分析级化学品均购自北京化学试剂(中国北京)。使用Milli-Q水净化系统获得去离子水(美国马萨诸塞州密立博市)。

弗洛里硅土(75–150mu;m)，硅胶(37–46mu;m)，中性氧化铝(75–150mu;m)和十八烷基甲硅烷基硅(ODS,50mu;m)分别从迪马科技(中国北京)、青岛高美化学(中国青岛)、中国医药生物制品研究所(中国北京)和YMC (日本)购买。多壁碳纳米管，羟基改性的碳纳米管(OH-MWCNTs)和羧基改性的碳纳米管(COOH-MWCNTs)是从成都有机化工公司(中国成都)获得的。木贼采自中国内蒙古自治区，并经过来自中国东北林业大学森林植物生态学重点实验室的聂绍荃教授的认证。收集的材料在室温下在阴凉处干燥，研磨，通过不锈钢筛(60目)，然后储存在阴暗条件下。

2.2 MSPD提取和UAE

MSPD提取过程:将200毫克磨碎的木贼和400毫克硅胶等分试样放入研钵中，并用杵将它们混合在一起，使样品完全粉碎并分散在固体支持硅胶上。混合完成后(2分钟后)，将均匀的混合物转移到底部带有聚乙烯玻璃料的料筒中。装载洗脱溶剂(8mL 80%甲醇)，并停止流经MSPD柱5分钟。然后，MSPD柱与一个小型真空泵相连，以确保溶剂完全洗脱。在UHPLC-MS/MS分析之前，将收集的MSPD提取物通过一次性0.45微米滤膜过滤。

UAE提取过程:将3.0g磨碎的木贼引入烧瓶中，并加入60mL 80%甲醇。然后将混合物在超声波浴(中国昆山超声波仪器公司KQ-250DB)中提取20分钟。真空过滤后，使用相同的条件再次提取所得残留物。在UHPLC-MS/MS分析之前，收集提取液，合并，并通过一次性0.45微米滤膜过滤。

2.3 超高效液相色谱和质谱的条件

使用与ESI-MS/MS耦合的超高效液相色谱仪对木贼的九种酚类化合物进行分析。色谱分析使用Waters ACQUITY UPLC ^TM系统(美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)进行，该系统配备有四元溶剂输送系统和自动取样器。在Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈柱( 50times;2.1 mm；id，1.7mu;m)中对分析物进行分离。流动相由0.1 %甲酸水溶液(A)和甲醇(B)组成，使用以下梯度洗脱用于分离: 0-1分钟，35 % B；1-2分钟，35-58% B；2-4分钟，58-75% B；4-6分钟，75-100% B；6-7分钟，100-35% B。柱温保持在30℃、流速设定为0.25mL/min，注射体积为5mu;L。

质谱分析是在AB Sciex QTrap 5500质谱仪上以负离子模式进行的。涡轮离子源设置如下:幕帘气体(CUR) 207kPa，碰撞气体(CAD)介质，离子喷射电压(IS)-4500 V，源温度(TEM) 500℃、离子源气体1(GS 1)379 kPa，离子源气体2(GS 2)379 kPa。分析物使用定时多反应监测(MRM)模式检测。表1总结了9种酚类化合物的前体离子和产物离子以及优化的MRM条件。

表 1九中酚类化合物的质谱参数

1. DP，去聚集潜力；CE，碰撞能量；CXP，碰撞单元退出电位。

2.4 验证研究

为了评估基质效应，如第2.2节所述，用MSPD提取木贼样品。向萃取溶液（1mL）中加入1mL两种已知浓度的标准混合物溶液，并用甲醇将另外1mL萃取溶液稀释至2mL。每种添加浓度制备三份样品。然后将标准加标样品溶液( A )中分析物的相应峰面积减去非加标样品溶液(B)中分析物的相应峰面积与等效浓度(C)下标准溶液的相应峰面积进行比较。比例[ (A - B) / Ctimes;100 % ]被定义为矩阵效应。

通过分析六种不同浓度的参考化合物，测试校准曲线的线性。分别以S / N 3 : 1和10 : 1测定每种分析物的LOD（检测限）和LOQ（定量限）。

通过对日内和日间的变化评估开发的UHPLC - MS / MS方法的精度。精确称量200毫克磨碎的木贼的试样等分，然后按照第2.2和2.3节所述的方法进行提取和分析。对于日内变异性测试，在一天内重复分析样品六次，而对于日间变异性测试，连续五天重复分析样品三次。计算每种分析物的保留时间和峰面积的相对标准偏差作为精确度的度量。

使用加标样品和木贼基质测试回收率。单独将一部分200毫克磨碎的木贼掺入一定量的本研究中分析的参考化合物中。用与第2.2节和第2.3节所述相同的方法提取和分析三个复制样品，以评估准确性。

1. 结果和讨论

3.1 优化MSPD程序

MSPD被认为是同时破坏原料和提取分析物的最有希望的技术之一[19]。本研究将MSPD萃取作为提取木贼活性成分的样品制备技术，研究了MSPD萃取参数，如分散吸附剂、分散吸附剂与样品的比例、洗脱溶剂及其体积。所有实验一式三份。

3.1.1 分散吸附剂的效果

分散吸附剂是MSPD过程中最重要的参数之一，因为它不仅被用作吸附分离材料，还被用作混合固体载体来破坏和分散原料。为了找到最合适的分散吸附剂，我们研究了弗罗里硅土、硅胶、中性氧化铝、ODS（十八烷基硅烷键合硅胶）、多壁碳纳米管、OH-多壁碳纳米管和COOH -多壁碳纳米管。80 %甲醇用作最初的洗脱溶剂。人们发现使用多壁碳纳米管、OH-多壁碳纳米管和COOH-多壁碳纳米管获得的九种活性成分的提取效率非常低(未显示)。这些分散吸附剂具有显著的疏水表面和独特的内部管腔结构，而且酚类化合物具有疏水性质。这导致这些分散吸附剂对酚类化合物具有很强的吸附能力，洗脱溶剂无法克服这种相互作用力[32]。图2A描述了使用其它分散吸附剂对木贼中酚类化合物的提取效率。在分散吸附剂硅弗罗里硅土、中性氧化铝和ODS之间发现萃取效率有显著差异。总的来说，硅胶以较低的成本显示出最高的酚类化合物提取效率。因此，在这项工作中选择硅胶作为最佳分散吸附剂。

3.1.2 分散吸附剂与样品比例的影响

一种合适的分散吸附剂与样品的比例可以完全吸附目标化合物。 因此，我们测试了四种不同比例的硅胶与样品，1:1，2:1，3:1和4:1并且使用80％甲醇作为洗脱溶剂。如图2B所示，硅胶与样品的比例对大多数酚类化合物的提取效率没有显著影响。 然而，当硅胶与样品的比例为2:1时，提取效率略高于其他三种比例。因此得出结论，选择硅胶与样品的比例为2：1作为以下实验的最佳比例。

图 2分散吸附剂（A）和吸附剂与样品（B）的比例对来自木贼的9种酚类化合物的提取效率的影响，提取效率表示为观察值与每种分析物的最大观察值的百分比。

3.1.3 洗脱溶剂和洗脱溶剂体积的影响

洗脱溶剂是MSPD过程中的另一个重要参数，因为合适的溶剂可以从复杂材料中有效和选择性地提取分析物[19,32]。在MSPD程序中对四种不同极性的溶剂，包括80%甲醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯，进行了检查。发现随着洗脱溶剂极性的增加( 80 %甲醇gt;甲醇gt;丙酮gt;乙酸乙酯)，所有酚类化合物，特别是极性更强的酚类化合物的萃取效率显著提高(支持信息 图S1A )。因此，选择80 %甲醇作为最佳洗脱溶剂。

此外，为了用最少体积的洗脱溶剂完全洗脱酚，我们也研究了洗脱溶剂体积对萃取效率的影响。分别用4.0、6.0、8.0和10.0 mL的不同洗脱溶剂体积提取样品。随着洗脱溶剂( 80 %甲醇)体积从4.0 mL增加到8.0 mL，萃取效率从约70 %显著增加到大于95 %，然后体积进一步增加到10.0毫升，没有增加有明显的变化(支持信息图S1B )。因此，考虑到萃取效率和溶剂消耗，MSPD过程中选择了体积为8.0 mL的洗脱溶剂。

3.2 色谱条件与质谱方法的发展

众所周知，色谱柱的效率以及流动相和洗脱程序的选择对于分析物的色谱分离至关重要。在这项工作中，使用一个短的填充有亚-2mu;m粒子( 50times;2.1 mm；id，1.7 mu;m )的 C₁₈色谱柱。使用这种超高效液相色谱柱与传统的柱相比，可以实现快速色谱分离，提高效率[33]。在以前的研究中，类黄酮苷在甲醇/水系统[34]中分离得很好。在类黄酮苷元如AP、LU和GE的分离中，甲醇/水[34，35]和乙腈/水[9，36]都已得到成功应用。在本研究中，通过酸化水( 0.1 %，v/v甲酸)和甲醇作为流动相的组合，在负波模式下给出了更好的峰形

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[278090]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word