现代固相多肽合成法外文翻译资料

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现代固相多肽合成法

Muriel Amblard,* Jean-Alain Fehrentz, Jean Martinez, and Gilles Subra

摘要：本文的目的是描述战略考虑，并提供切实可行的程序，使非专家合成肽具有合理的成功机会。本文不是百科全书，而是致力于固相肽合成（SPPS）的FMOC/TBU方法，这是目前最常用的制备肽的方法。SPP的原理与目前使用的连接器和支持的评论。讨论了SPPS的不同步骤如锚定、脱保护、偶联反应和解理的基本概念，以及聚合反应和副反应的可能问题。提出了合成完全脱保护肽的基本方案，包括树脂处理、偶联、封端、FMOC脱保护、最终裂解和二硫键形成。

关键词：固相肽合成（SPPS）；树脂；FMOC-SPPS；偶联试剂；保护基团；副反应。

1. 简介

目前，“肽合成”包括大范围的技术和程序，使得从小肽到大蛋白的材料的制备。Bruce Merrifield^[1]的开创性工作，引入固相肽合成（SPPS），极大地改变了肽合成的策略，简化了与溶液相合成相关的繁琐和苛刻的纯化步骤。此外，Bruce Merrifield的SPPS也允许自动化的发展和广泛范围的机器人仪器现在可用。在定义合成策略并对肽的氨基酸序列进行编程之后，机器可以自动执行制备多个肽样品所需的所有合成步骤。SPPS现在已经成为生产肽的选择方法，虽然溶液相合成仍然可以用于大规模生产给定肽。

2.实验材料

1.反应容器（图1）

2. 聚四氟乙烯（PTFE）棒（15厘米长，直径0.6-0.8厘米）。

3.搅拌转子

4.过滤瓶。

5.多孔玻璃材料。

6.冻干机。

7.高效液相色谱（HPLC）配备反相C₁₈柱。

8.pH-指示纸。

图1.固相多肽合成反应器

9.溶剂（N，N-二甲基甲酰胺[DMF]，甲醇[MeOH]，

二氯甲烷[DCM]）。

10.二异丙基乙酰胺（DIPEA）。

11.在DMF中的哌啶溶液（20:80）。

12. Kaiser测试溶液（茚三酮，吡啶，苯酚）（注1）。

13.具有受保护侧链的Fmoc-氨基酸（表格1）。

14.三氟乙酸（TFA）。

15.三异丙基硅烷（TIS）。

16.叔丁基甲基醚（MTBE）。

3.方法

3.1. 固相多肽合成法原理

由于肽合成涉及许多重复步骤，固体载体的使用具有明显的优点。通过这样的系统，在高浓度下大量过量的试剂可以驱动耦合反应完成。过量的试剂和副产物可以简单地通过过滤和洗涤从生长的和不溶的肽中分离出来，并且所有的合成步骤可以在同一容器中进行，而不需要任何材料的转移。

SPPS的原理如（图2）所示。N-保护的C-末端氨基酸残基通过其羧基锚定为羟基（或氯）或氨基树脂，分别产生酯或酰胺连接的肽，最终产生C-末端酸或C-末端酰胺肽。在加载第一氨基酸后，通过N-alpha;去保护和氨基酸偶联反应的重复循环，将所需肽序列以线性方式从C-末端组装到N-末端（C-N策略）。

氨基酸的侧链官能团必须用在肽伸长期间使用的反应条件下稳定的永久保护基（Pn）掩蔽。alpha;-氨基通过通常为氨基甲酸乙酯衍生物的临时保护基（T）保护。临时保护基团（T）可以在温和条件下轻易去除，以保持肽的完整性并降低差向异构化的速率，这可以通过偶联步骤（2,3）期间活化的氨基酸形成5(4氢)-恶唑酮为如(图3)所示。氨基甲酸乙酯对差向异构化的保护作用也解释了C-N策略的优势。

偶联后，通过过滤和洗涤除去过量的反应物。 临时的N-末端保护基团被除去，允许通过活化其alpha;-羧酸加入下一个N-氨基甲酸乙酯保护的氨基酸残基。重复该过程（去保护/偶联）直到获得期望的序列。在最后一步中，从树脂中释放肽并同时除去侧链保护基团（P_n）。

3.2. Fmoc/tBu 固相多肽合成法

在SPPS中，使用了两种主要策略：BOC/BZL和用于T/PN保护组的FMOC/TBU方法。前者的策略是基于侧链保护基团的分级酸不稳定性。在这种方法中，BOC组通过二氯甲烷和侧链保护基团中的整齐三氟乙酸（TFA）或TFA除去，并且在合成结束时用强酸性如无水氢氟酸（HF）处理除去肽-树脂连接。虽然这种方法允许有效合成大的肽和小的蛋白质，但是使用高毒性的HF和特殊的聚四氟乙烯衬里的设备限制了这种方法仅适用于专家。此外，强酸性条件的使用会产生含有脆性序列的肽结构完整性的有害变化。

FMOC/TBU方法是基于正交保护群策略的。这种方法使用碱不稳定的N- FMOC基团来保护alpha;-氨基功能、酸不稳定侧链保护基团和酸不稳定的连接体，它们构成C-末端氨基酸保护基。后一种策略的优点是，通过不同的机制重新进行临时和永久正交保护，允许使用温和的酸性条件进行最终脱保护和从树脂中裂解肽。由于所有这些原因，基于FMOC的SPPS方法现在是常规合成肽的选择方法。

3.3.固相载体

基质聚合物和连接剂可以表征固体载体（5）。通常，术语“树脂”不正确地代替连接系统，忽略了基质聚合物与溶液相（6）在支持化学中同样重要的事实。由于数百种不同的树脂在市售，其中一些携带相同的连接件，应特别小心，以选择最合适的连接剂用于合成。

3.3.1. 基质聚合物

交联聚苯乙烯（PS）基树脂是最常用的常规SPPS。200至400目尺寸分布（对应于直径约50mu;m）和0.5～0.8 mmol/g的负载珠在溶剂（如DMF和DCM）中的聚合物溶胀具有良好的特性，反应物扩散到聚合物基质中，以及可链接的嵌入位点的可访问性。对于较大的肽（超过25个氨基酸）或更困难的序列，需要较低的负荷（0.1～0.2 mmol/g）。

交联聚酰胺基树脂（PA）和复合PS聚乙二醇（PEG）基树脂比PS树脂更亲水性的支持。它们在微观和宏观水平上表现出不同的物理性质（7）。这些载体，通常具有较低的承载能力，可能代表了用于合成困难序列和大肽的标准交联PS树脂的替代品。

3.4.树脂的处理

3.4.1. SPPS 反应容器

SPPS可以在经典玻璃反应容器中进行，这些玻璃反应容器可以由玻璃吹制器制造或从制造商购买（图1）。或者，也可以使用

配备PTFE或玻璃熔块的注射器。根据（表2），反应容器的尺寸应与所用树脂的量

表1.天然蛋白原氨基酸

相关。

3.4.2.溶剂

由于99%的偶联位点不在表面，而是在树脂珠粒内，携带生长肽链的珠粒的膨胀对于活化的N-保护氨基酸在聚合物基质中的最佳渗透是必不可少的，从而提高偶联产率。在开始固相合成之前，树脂必须在适当的溶剂（例如DCM或DMF）中膨胀20至30分钟（方法1）。对于在SPPS使用的交联聚苯乙烯小球，DCM呈现出最佳的溶胀性能。对于偶联步骤，优选极性非质子溶剂如DMF或NMP以提高反应物的溶解度。醇和水不是PS树脂的合适溶剂（见附注2）。然而，在洗涤步骤（方法2）中可以使用甲醇或异丙醇来收缩PS树脂珠。这种收缩将有效地去除过量的反应物。在这种治疗后，PS珠应膨胀在DCM或DMF。

3.4.3搅拌混合

图2 固相合成示意图

没有必要强烈搅拌反应容器，因为扩散现象决定了SPPS中的动力学反应。此外，大多数用于肽合成的树脂珠是易碎的，因此不推荐磁性搅拌。一个旧的旋转蒸发器转子可用于在耦合和脱保护步骤中搅拌，或者交替地通过摇动或涡旋进行平滑搅拌的任何设备是合适的。由于珠通常粘在玻璃上，重要的条件是反应器的所有表面在搅拌过程中必须与反应混合物接触。

3.4.4 洗涤

清洗步骤对于去除可溶性副产物和偶联和脱保护步骤中使用的反应物的过量是必不可少的。将反应器中含有的溶剂装入反应器中，在真空下将其倒空是一种合适且简单的方法。如果需要，可以在聚四氟乙烯棒中进行树脂在洗涤溶剂中的搅拌和混合。

表2. SPPS反应容器的类型

图3. 恶唑酮的异构化反应

图4. 肽酰胺合成用树脂

规则1：树脂膨胀

1.将干树脂放入适当的反应物中

（参见子标题3.4.1）。

2.用DCM填充反应器直到所有树脂珠粒

沉浸在。 树脂悬浮液可以轻轻地

与PTFE棒混合。

3.离开20到30分钟。

4.在真空下过滤除去DCM。

规则2：标准清洗程序

1.用DMF填充反应容器。

2.保持10秒，过滤除去溶剂。

3.小心地清洗螺帽和螺丝的边缘

带有DMF的反应器。

4.用DMF重复步骤1和2两次。

5.用MeOH重复步骤1和2。

6.用DCM重复步骤1和2。

7.用DMF重复步骤1和2。

3.5.基于FMOC保护基的连接剂和树脂

SPPS的第一步是通过靶肽（分别是酸或酰胺）的C-末端官能团的酯或酰胺键将N-保护的C-末端氨基酸残基锚定（或加载）到固体载体上。大多数的连接器是商业上可用的固定在不同的树脂（PS，PA，PEG-PS）。下面段落中使用的珠（球）符号是通用的，不指特定的树脂。

3.5.1. 肽酰胺类

对于C-末端肽酰胺的合成，常用的树脂为1～3（图4）（8～10）。这些树脂与FMOC化学和最终TFA裂解相容。对于第一氨基甲酸乙酯N-保护残基的附着，可以使用标准肽偶联程序（方案5）。这些树脂通常被提供FMOC保护，并且在加入第一残留物之前应该被保护掉。对于大的C-末端氨基酸，双偶联步骤可能是必要的。

3.5.2. 肽类酸

通过酯化将氨基酸锚定到固体载体上往往更困难，甚至是有害的，对于一些残基，并且可能导致差向异构化、二肽形成和低取代。因此，我们建议购买预加载的第一个C-末端N-保护氨基酸的树脂，这些是从各种制造商的商业上可获得的。在Fmoc / TBU合成C-末端肽酸的策略中常用的树脂见图5（11 - 14）。锚固反应必须在无水介质中进行，含水的氨基酸在使用前应干燥。

3.5.3.羟甲基树脂

对于羟甲基基树脂4至6，与不具有阻碍性的树脂（如王氏树脂4）相比，具有与除去甲氧基5和6的树脂相比，酯键的形成更容易。最常用的酯化方法是对称酸酐法（方案3）。负载的测定可以通过FMOC释放测量来执行（见注释3）。在难以锚定的情况下，酯化

图5 多肽合成树脂

步骤可以用新鲜反应物重复。精氨酸衍生物需要三个酯化步骤以达到正确的负载。锚定后，未反应的树脂结合的羟基应被苯甲酸酐或醋酐封端（见方案3，步骤8）。

协议3：对羟甲基树脂的附着

1.将树脂放入合适的SPPS反应器中。

2.按照方案1所述溶胀树脂。

3.所需的Fmoc-氨基酸（10当量相对于树脂替代）置于干燥的，带磁力搅拌器的圆底烧瓶中在0℃溶解于无水DCM（3mL/mmol）。一些干燥的DMF滴可能是有用的实现完全溶解。

4.加入DIC（5当量）并搅拌混合物在0℃下保持10分钟。如果观察到沉淀物，加入DMF直至溶解并搅拌10分钟更多。

5.将溶液加入羟甲基树脂中。

6.将二甲基氨基吡啶（DMAP）（0.1-1当量）的DMF溶液并将溶液加入反应混合物。

7.搅拌1小时后，用DMF洗涤树脂（三次），最后是DCM。

8.在真空中干燥树脂18小时，然后进行对样品进行Fmoc释放测量（见注3）。当负载小于

70％，重复酯化步骤。

9.达到期望的替代时，上限剩下的羟基通过加入苯甲酸或乙酸酐（5当量）和吡啶（1当量）的DMF溶液（预先溶胀） 并搅拌30分钟。

10.清洗树脂（方案2）并开始经典与N-保护的氨基酸延伸后Fmoc去保护（第7号协议）。

3.5.4. 三苯甲基树脂

基于三苯甲基的树脂高度不耐酸。接头的空间位阻阻止了二酮哌嗪的形成，推荐Pro和Gly C末端肽使用这些树脂。非常温和的酸解条件使受保护的肽片段从树脂上裂解。这些树脂可作为其氯化物或醇前体购得。三苯甲基氯树脂对湿度极其敏感，因此试剂和玻璃器皿在使用前应小心干燥，以避免水解成酒精形式。有必要激活三苯甲醇前体，强烈建议在使用前重新激活氯化物（见注4）。活化后，通过在碱存在下与Fmoc氨基酸衍生物

反应而发生第一个残基的连接。该反应不涉及活化物质，因此不存在差向异构化。应对活化过程中对差向异构体特别敏感的Cys和His残基采取特别的预防措施（表2）

议定4：附加基于TRITYL的树脂

1.将1克三苯甲基类树脂（1.0-2.0mmol

氯化物/ g树脂）在SPPS反应容器中。

2.按照方案1所述溶胀树脂。

3.加入3当量的Fmoc氨基酸溶液

7.5当量DIPEA的无水DCM溶液（10-mL / g树脂）。

4.在室温下搅拌混合物30至60分钟。

5.用DMF洗涤树脂（2-3次）。

6.加入10mL的DCM / MeOH /

DIPEA（80：15：5）盖住任何剩余的反应物

氯化物基团。

7.混合15分钟并过滤。

8.用DMF和DCM清洗树脂三次。

真空干燥后，取代可以是

从Fmoc释放测量（见注3）。

3.6.侧链保护基团

我们将将侧链

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