液相色谱串联（Orbitrap）高分辨率质谱仪同时测定茶和凉茶中的托品烷类生物碱的含量外文翻译资料

液相色谱串联（Orbitrap）高分辨率质谱仪同时测定茶和凉茶中的托品烷类生物碱的含量

摘要

我们提出了一种同时测定茶和凉茶中的13种托品烷类生物碱含量的新方法，它使用了高效液相色谱串联Exactive-Orbitrap质谱分析仪。使用甲醇、水和甲酸的混合物提取目标化合物，然后进行固相萃取步骤。这种经验证过的方法提供了从75到128%的回收率，其日内、日间精密度低于或等于24%（除阿托品外）。最低定量限从5到20ug/kg。我们分析了11种茶和凉茶样品及2种受曼陀罗种子污染的样品。发现在六个样品中含有托品烷类生物碱，其浓度在5ug/kg（阿朴阿托品）到4340ug /kg（假托品碱、托品碱)之间,而在受污染的样品中浓度是在5ug/kg （阿朴阿托品)到1725 ug/kg（假托品碱、托品碱）之间。

关键词：膳食补充剂；凉茶液相色谱-Orbitrap；茶；托品类生物碱

一.前言

托品烷类生物碱(TAs)是一类众多植物（像茄科、红木科、蛋白质科、大戟科、根霉科、旋花科、十字花科）中天然存在的次生代谢产物，有200多种。

茄科是托品烷类生物碱最大的来源，并且一些茄科的属，如曼陀罗属、木曼陀罗属、澳茄属、颠茄属、莨菪属和赛茛菪属都是因为有高含量的托品烷类生物碱而出名[1-3]。虽然托品烷类生物碱主要是在生物根系中合成的，但它们被木质部血管从根系转移到植物的上部，所以它们存在于植物的所有部位[4]。

含托品烷类生物碱的植物在很早之前就非常有名了，而且用途广泛[5,6]。现在，我们主要从东莨菪碱和阿托品植物中提取托品烷类生物碱，并把他们运用到现代医学中，它们还可以作为一种解毒剂，对抗用作杀虫剂的有机磷衍生物和一些神经毒气[5-7]。

含TAs的植物是耕地、荒地、空地和其他被破坏的栖息地上的杂草，检测饲料和食物中TAs含量是很有用的，因为在食用富含TAs的植物时发生过食物中毒病例，像误食曼陀罗。大部分商业的谷物和种子，如小麦、黑麦、大豆都可能会被TAs污染[1,8,9]。食品安全研究所的一份报告[10]总结可能含有TAs的食物是草药茶，草药制剂（例如，中国传统茶叶或阿育吠陀茶），蓝莓或黑莓，还有可食用的花。在受污染的荞麦（供人类食用）、大豆和亚麻仁（动物饲料）中也发现了TAs[11,12]。

因为这些化合物的高毒性和中毒病例的数量[1,11]，欧洲食品安全局(EFSA)建立了一个阿托品、东莨菪碱的总急性参考剂量：每千克体重0.016micro;g [2]。要知道已经发现了200多种TAs，这个标准参考剂量排除了大量可能有毒的化合物。

气相色谱、液相色谱和毛细管电泳[13-15]是分析、分离TAs时最常用的技术[16]。使用气相色谱法时，玻璃的毛细管柱如DB1或DB5可以很好地分离许多生物碱，具有很高的灵敏度和选择性，虽然气相色谱分析有衍生的步骤[9,13]。

液相色谱和质谱由于它们的高选择性和高灵敏度成为了主要的检测系统。一些在茄科植物[17-19]、体液[20-23]、谷类作物[8,19,24]、凉茶和茶[12,19,20]中检测TAs的含量的方法是有效的，通过液相色谱串联质谱，含量在mu;g/kg或mu;g/L的化合物都可以检测出来。除Mulder[19]的研究外，以上方法均未分析超过7种TAs，且大多数仅定量分析东莨菪碱和阿托品。

2008年台式Exactive-Orbitrap质谱仪生产出来[25]，超高分辨率（100 000FWHM）使其成为分析各类霉菌毒素[26]、植物毒素[27,28]或生物碱[29]的有力工具。然而,基于全扫描高分辨率(Orbitrap)质谱(MS)串联液相( LC)的测定TAs的方法目前还很少见，虽然有些方法已被用于测定食物、饲料和草本提取物中的TAs[30]。

关于提取方法，TAs可以从基质中用水、有机溶剂或酸，碱性的水/有机溶剂混合物提取。大多数文献报道的提取方法仅适用于东莨菪碱和阿托品[12,17,24]，还有一些同时分析的方法[7,8,19,20,31]使用甲醇/水或乙腈/水混合物。在一些研究中，TAs是用SPE法，用不同的吸附剂如Diapac C18[18]、SolEx HRP[31]或Oasis MCX[19,32]提取出来的。

由于TAs物理化学性质的变化，例如极性和PKa值，所以研究同时提取托品烷类生物碱的方法是一个挑战。最近，EFSA发布了一项关于不同食物中[19]（如谷类和相关产品、茶和豆类）中TAs的研究。在该研究中，使用甲醇和水的酸性混合物提取24种TAs，然后进行SPE，在干燥的药茶中获得20 - 127%的回收率，突出了在茶和凉茶等复杂基质中获得良好效果的难度。

因此，这项研究的目的就是发现一种能有效在凉茶或茶中同时提取分析TAs（山莨菪碱、阿朴阿托品、阿托品、古红豆碱、马托品、利托林、假托品碱、东莨菪碱、托品烷、托品碱和托品酮）的方法。这种方法通常使用LC串联Exactive-Orbitrap质谱分析仪，这是首次使用高分辨率MS (HRMS)分析TAs。

二.材料与方法

2.1化学试剂和仪器

阿托品（纯度gt; 99%），东莨菪碱、托品酮（纯度99%）、山莨菪碱、托品烷、后马托品（纯度98%），托品醇（纯度97%）采购自Sigma - Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。莨宕酮、假托品碱从化学制剂（中国，武汉）购买，纯度98%。阿朴阿托品、东茛菪碱和红古豆碱 （纯度98%）由Santa Cruz生物科技公司(Santa Cruz, TX, USA)提供。

液相色谱-质谱级甲醇，液相色谱-质谱级乙腈，高效液相色谱级丙酮，氢氧化铵溶液（纯度ge;25%）都是从Sigma-Aldrich处购得。液相色谱-质谱级水从西班牙巴塞罗那的Scharlab获得，乙酸和甲酸从比利时的Fisher Scientific公司获得。甲酸铵和氯化钠是从Sigma-Aldrich公司购买，而无水硫酸镁和乙酸铵从Panreac公司（西班牙，巴塞罗那）购买。

各化合物的标品用甲醇配成200 mg/L的储备液，配制中间浓度的溶液，分别为5 mg/L和20 mg/L，1 mg/L和10 mg/L。所有的溶液都是储存在4℃。原液1年内稳定，中间溶液可存放2个月。

梅特勒托莱（瑞士，Greinfesee）的分析天平AB204-S， Velp Scientifica （意大利，Usmate）的旋涡混合器WX， Heidolph（德国，Schwabach）的旋转搅拌器Reax 2和（西班牙，巴塞罗那）的离心机Centronic BL II被用于样品处理。从Phenomenex（美国，加利福尼亚州，托兰斯）买的Strata-X-C 200mg/ml固相萃取柱和0.45mu;m尼龙滤头从安捷伦（美国，加利福尼亚州，圣克拉拉）买的也在使用。

2.2样品收集

不同种类不含咖啡因的凉茶和茶都是从阿尔梅里亚（西班牙）当地的商店买的。他们买了两种绿茶，一种含有马黛茶，另一种含有薄荷，以及一种皮卡迪利茶和一种中国红茶。此外，还分析了七种草本茶:两种鲁伊伯斯茶、一种薄荷茶、一种放松茶、一种阿育吠陀香料茶、一种古柯叶茶，以及一种安哥拉决明子和鼠李茶的混合物。这些样品是根据欧洲食品安全局的关注和RIKILT报告选出的[10]。

曼陀罗种子样品中，TAs浓度最高，购自西班牙韦尔瓦。因此，一种茶（含薄荷的绿茶）和一种凉茶(m.p earlicum tea)被曼陀罗种子(分别为茶2*和凉茶3*)污染。通过将10mg的均匀种子加入到10g的粉末样品中，在旋转搅拌器中搅拌1h使混合物均匀。

2.3样品提取

精确称取1克样品加入到50ml聚丙烯离心管中，加入10 mL甲醇/水/甲酸（75:25:0.4，v/v/v），在旋转搅拌器中摇匀30分钟。混合物在5000rpm （4136g）下离心5min，取5ml上清液用于SPE步骤。

2.4 SPE纯化

首先用6ml甲醇对Strata-X-C固相萃取柱进行活化，然后用6ml甲醇/水/甲酸（75:25:1，v/v/v）平衡。5ml提取物的上清液上样，然后用6ml甲醇/水/甲酸（75:25:1，v/v/v）淋洗，固相萃取柱真空抽干1小时，6 mL 含 3%氨水 （25%）的甲醇溶液洗脱，氮气吹干洗脱液，1 mL （90:10,，v/v）水/甲醇复溶。

2.5液相-质谱Orbitrap分析

对于色谱分析， 我们使用美国加利福尼亚州圣何塞市Thermo Fisher Scientific公司的超越TM600的液相色谱。色谱分离是通过使用Eclipse Zorbax plus HILIC柱（100times;2.1毫米，1.8mu;m粒径）和一个由安捷伦科技（美国，加利福尼亚州，圣克拉拉）公司提供的Zorbax Eclipse C18柱（100times;2.1毫米，1.8mu;m粒径）。从Waters（西班牙，巴塞罗那）购买了一个Nova-Pakreg;C8柱（150times;3.9毫米，4mu;m粒径），以及从Phenomenex（西班牙，马德里）获得的Phenomenex Gemini C18柱（250times;3.0毫米，5mu;m粒径），Hypersil Gold Phenyl柱（100times;2.1毫米，1.9mu;m粒径）和Hypersil GOLD aQ C18柱（100times;2.1毫米，1.9mu;m粒径）在优化过程中被使用。

梯度洗脱分离化合物，流动相A（0.1%甲酸/水溶液）和流动相B（乙腈），流速为0.2 mL/min。梯度从90%的 B开始，维持1分钟，然后B下降到70% 冲洗4分钟, 继续下降到50%冲洗2分钟，最后以5%的B冲洗2分钟。这种状态维持1分钟，然后在2分钟内线性增加到50% B，在2分钟内恢复到初始状态，保持4分钟以达到平衡。总运行时间是18分钟。色谱柱温度设定在25℃和进样量为10mu;L。

Exactive-Orbitrap（德国，不来梅，赛默飞世尔科技）使用加热的ESI (HESI-II)接口（赛默飞世尔科技）在阳离子模式下检测，使用以下参数:电喷射电压在4 kV，除油船电压在18 V,毛细管电压在35 V，管透镜电压在95 V，保护气（N₂） 35个单元，辅助气（N₂）10（单元），加热器温度305 ℃，毛细管温度300 ℃。使用质谱的分辨率为25,000FWHM,扫描时间0.25秒，完全没有分裂。然后我们用10000FWHM能量 ,扫描时间为0.10s，分裂模式使用碰撞能量更高的能量碰撞离解(HCD) 30eV的碰撞模式能将其完全分裂。

使用外部校准模式采集色谱图，使用XcaliburTM 2.2版用Quanbrowser 和 Qualbrowser处理。

2.6方法学验证

一旦提出该方法，就应验证它在目标化合物的检测和定量方面的适用性。由于缺乏对植物毒素方法验证的具体规定和指南，以SANTE[33]和AOAC指南[34]作为参考。通过计算基质效应、线性关系、日内和日间精度（表示为RSD）、准确度（用回收率表示)）和LOQ（最低定量限）等参数进行有效的验证。

首先，通过分析在溶剂和茶叶基质中的标准曲线去研究基质效应，在萃取过程（基质匹配曲线）后加强。计算两个斜率之间的比值，如果不存在基质效应，应在0.8 -1.2之间。比值小于0.8表示抑制作用，比值大于1.2表示增强作用。

线性评估在空白样品提取浓度在0.5-50mu;g / L之间的峰面积对浓度作图的最小二乘回归，计算线性相关系数(R²)。阿托品，去水阿托品和托品烷的线性范围从2.5到50mu;g/L ；山莨菪碱，托品醇，托品碱，东莨菪碱，和托品烷的线性范围为5-50mu;g / L；东崀宕碱，后马托品的线性范围为7.5- 50mu;g / L 和红古豆碱的线性范围为10到50mu;g / L。线性关系确定了实验范围，使样品中分析物的量化范围为阿朴阿托品，阿托品和托品烷从5到100mu;g /kg；山莨菪碱，托品醇，托品碱，莨菪碱和托品烷从10到100mu;g/kg；东崀宕碱和后马托品5-100mu;g /kg;和红古豆碱为20 - 100mu;g /kg。

精确度是通过计算在两个不同浓度水平（15和100mu;g /kg）的回收率。为了计算这一点，5个空白样品在同一天（日内精密度或重复性）和连续5天（日间精密度或重现性）中加标萃取5次。

分析不同浓度水平（1、5、10、15、20和25mu;g /kg）的空白样品进行定量限测定。最低定量限是指在相同的保留时间(RT)和相同的色谱剖面上，质量误差小于5ppm的特征离子和质量误差小于10ppm的片段离子的最低浓度，且同时有很好的线性。

三.结果与讨论

3.1优化Orbitrap-MS条件

首先，在LC-Orbitrap系统中以1mg /L的浓度注入每种化合物的标准溶液，优化光谱条件。为了选择特征离子和片段离子，我们采用了以前的方法[35]。为了确定每个化合物的特征离子，进行了MS采集检测撞击室中有无碎片。处理每种化合物的化学公式是为了得到理论质量。我

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