石墨烯包裹的二氧化硅作为基质固相分散萃取吸附剂，用于分析七里香叶中的聚甲氧基黄酮类化合物外文翻译资料

石墨烯包裹的二氧化硅作为基质固相分散萃取吸附剂，用于分析七里香叶中的聚甲氧基黄酮类化合物

原文作者：TingSun，XuwenLi，JieYang，LanjieLi，YongriJin，XiaoleiShi

单位：JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE

摘要：在该研究中，通过水热还原策略合成石墨烯包封的二氧化硅。通过傅立叶变换红外光谱，X射线衍射和扫描电子显微镜鉴定石墨烯中二氧化硅的存在。随后将石墨烯包封的二氧化硅用作吸附剂，用于七里香的干燥叶中聚甲氧基黄酮的基质固相分散萃取。与其他吸附剂（石墨烯，硅胶，C18二氧化硅，中性氧化铝，硅藻土）和没有任何吸附剂相比，获得了更好的结果。然后通过基质固相分散萃取与超高效液相色谱和紫外检测相结合，建立了聚甲氧基黄酮类化合物的分析方法。然后通过基质固相分散萃取与超高效液相色谱和紫外检测相结合，建立了聚甲氧基黄酮类化合物的分析方法。与回流提取和超声提取相比，该方法更快，更有效，更环保。从提取到检测需要不到10分钟。

关键词：黄酮类；石墨烯；基质固相分散；七里香；中药

1 介绍

七里香作为一种重要的中草药，已成为强化药理和化学研究的有吸引力的课题。到目前为止，已经证明这种植物的叶子具有显着的抗伤害作用，抗菌，抗真菌和抗氧化剂^[1,2]。它被广泛使用，对治疗浅表性胃炎，糜烂性胃炎和肠上皮化生有很好的疗效^[3]。我们实验室以前的工作表明，聚甲氧基黄酮类化合物被认为是九里香叶片中的代表性化合物^[4,5]，它们是所列药物三九味泰颗粒的主要活性成分。因此，开发这种草药中多甲氧基黄酮类化合物的快速简便方法具有重要意义。

随着分析方法的快速发展，色谱分析之前的样品制备程序对于确定由于极端复杂性基质而导致的目标组分非常重要。已经应用各种提取方法从R中草药中提取主要有效成分，例如回流提取和超声波提取。然而，这些提取方法通常是多步骤，耗时且需要大量溶剂。与传统的萃取方法不同，基质固相分散（MSPD）具有一些优点。MSPD是一种有效的样品制备程序，包括样品均质化，在一个步骤中从固体或半固体基质中提取和分馏目标组分^[6]。它已被广泛应用于各种样品的分析过程，例如食品，植物和动物组织中的污染物，人类生物样品，环境样品，化妆品^[7]。最近，MSPD方法已成功应用于药用植物中的化合物分析^[8-11]。

对于MSPD，有效吸附材料的应用至关重要。如今，硅胶，C18二氧化硅，中性氧化铝和硅藻土因其大的表面积和丰富的孔径而被广泛使用。但它们在提取低含量化合物时效率低。因此，寻找具有高负载能力，选择性吸附能力和快速吸附速率的新吸附剂是重要的。

石墨烯是一种原子厚的2-D材料，包括单层六边形sp2杂化碳，近年来引起了很大的科学兴趣。它具有较大的比表面积（2630 m²/g）^[12]，化学稳定性，柔韧性和富电子结构，是吸附材料的理想选择^[13-17]。然而，直接使用的石墨烯作为吸附剂存在一些问题，即由微小的石墨烯片引起的玻璃料阻挡；难以从分散良好的溶液中完全收集微小的石墨烯；由于其高表面积，通过范德华相互作用产生不可逆的聚集^[18]。这些可能降低吸附能力和提取效率。固定在氨基硅胶表面的石墨烯可以避免上述问题并保持石墨烯片的有利特性。石墨烯包封二氧化硅（GES）的独特性质使其在污染物^[18,19]，蛋白质，肽^[20]和血红蛋白^[21]中具有多种应用前景。对于其大的离域电子系统，GES可以通过强相互作用与苯环化合物相互作用。因此，预期它是一种有前景的吸附剂，用于提取天然产物中的聚甲氧基化黄酮类化合物。据我们所知，没有关于GES在聚甲氧基化黄酮类化合物上应用MSPD提取方法的相关报道。

在这项工作中，GES是通过水热还原法制备的，并且可用于提取主要生物活性成分，包括5,7,3，4- 四甲氧基黄酮（A），5,7,3，4，5- 五甲氧基黄酮，5,6,7,3，4，5- 六甲氧基黄酮（C）和3-羟基-5,7,4-三甲氧基黄酮（D）通过MSPD提取方法与UHPLC-UV检测相结合。测试几种分散剂和洗脱溶剂用于比较。此外，还比较了回流提取（RE），超声提取(UE)和提出的方法的提取效率。

2 材料和方法

2.1 试剂和材料

石墨片（99.95 ％，粒径30 mu;m）得自阿法埃莎（希舍姆，英国）。氨基硅胶（NH2-SiO2，氨基丙基硅胶，粒径45 mu;m）购自西格玛奥格里奇（圣路易，MO）。硅胶（200-300目），碱性氧化铝（100-200目）和中性氧化铝（100-200目）购自青岛海洋化学附属工厂（青岛，中国）。硅藻土购自天津光复精细化工研究所（天津，中国）。HPLC级乙腈从赛默飞世尔（匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）获得。空聚丙烯SPE注射器（1 mL容量）和聚乙烯玻璃料（20微米孔隙率）购自博纳艾杰尔（中国天津）。所有其他试剂均为分析级，购自北京化工厂（北京，中国）。

七里香的叶子，凭证标本编号为JLU-JLX20131001，于10月收集，购自中国云南省，由中国长春中医药大学邓明禄教授鉴定。将叶子干燥，压碎并通过80目筛。在我们的实验室里从七里香的叶子制备聚甲氧基化的黄酮类化合物A（98.4 ％），B（99.9 ％），C（97.8 ％）和D（97.6 ％）。化合物的化学结构如图1所示。

*：取代基的位置

图1.聚甲氧基黄酮类化合物的结构

2.2 仪器

使用Varian 800 FTIR光谱仪（USA）进行IR吸收光谱。用多功能粉末X射线衍射仪（荷兰）获得X射线衍射（XRD）光谱。在日立SU8010扫描电镜仪器（日本）上记录SEM图像。用KQ-100DE昆山超声仪器（中国）进行超声波实验。具有UV检测器的沃特世超高效液相色谱用于所有实验。使用超高效液相色谱BEHC 18柱（2.1times;50 mm，1.7 mu;m）进行色谱分析。对于聚甲氧基化黄酮类化合物分析，仪器条件如下：波长，337 nm;柱温，30 ℃;注射量，5 L;流速，0.3 mL/min;流动相，乙腈/水（35:65）。总运行时间为3分钟。在UHPLC分析之前，将所有样品溶液通过0.22 mu;m滤膜过滤。

2.3 GES的合成

氧化石墨烯（GO）通过改进的Hummers方法由石墨薄片制备^[22,23]。根据文献，通过水热还原法合成GES^[19]。简而言之，GES由GO包封的二氧化硅通过水热还原制备。通过GO的羧基在水溶液中与氨基末端的二氧化硅的氨基连接来制造GO包封的二氧化硅。具体来说，将125.0 mL氨基硅胶分散体和125.0 mL含水GO悬浮液（2.0 mg/mL）加入烧杯中。在室温下搅拌约2小时后，将混合物转移到400 mL特氟隆衬里的不锈钢高压釜中并在230 ℃下反应3小时。通过在DMF的帮助下浮选除去游离石墨烯后获得GES。然后用乙醇洗涤GES三次，然后在60℃下干燥。

2.4 标准溶液的制备

通过将34.62,22.08,10.29和19.72 mg化合物A，B，C和D分别用甲醇溶解成10 mL并储存于4 ℃下的冰箱中来制备标准溶液。库存标准溶液通常能很好地储存在实验室冰箱中几个月。通过用甲醇稀释标准溶液来制备标准工作溶液。

2.5 样品制备

2.5.1 MSPD提取

在最佳操作条件下，将25.0 mg样品，50.0 mg分散剂置于玛瑙研钵中,用研杵混合3分钟，得到均匀的混合物。一旦完全分散，将均匀混合物装入1 mL聚丙烯筒中。聚乙烯上部和下部玻璃料保留在筒的每个末端以将混合物填料保持在适当位置。通过重力流动以5 mL甲醇的体积完成洗脱。将洗脱液收集到烧瓶中并用甲醇稀释至10 mL。将等分试样的该溶液（80 mu;L）用甲醇稀释至5 mL，得到试验溶液。

2.5.2 回流提取

将样品粉末（0.25 g）和25 mL甲醇放入50 mL圆底烧瓶中。分别加热和回流三次，持续30分钟。将萃取液冷却至室温并过滤。合并萃取物，用甲醇稀释至100 mL。将等分试样的该溶液（50 mu;L）用甲醇稀释至6 mL，得到试验溶液。

2.5.3 超声波提取

在超声装置中以45 kHz将样品粉末（0.25 g）用25 mL甲醇超声处理30分钟（三次）。超声处理过程在室温下进行。过滤后，合并萃取液，用甲醇稀释至100 mL。将等分试样的该溶液（50 mu;L）用甲醇稀释至6 mL，得到试验溶液。

3 结果和讨论

3.1 GES的表征

通过FTIR，XRD和SEM表征GES。GO，石墨烯，氨基硅胶和GES的FTIR光谱如图2所示。

图2.氧化石墨烯，石墨烯，氨基硅胶和GES的FTIR光谱

在GO光谱上，可以观察到几个特征峰，证实了石墨的成功氧化。在3410,1735,1597,1064 cm^-1处的带归因于O-H，C=O，芳族C=C和烷氧基C-O的拉伸振动^[24]。对于GES，大多数GO带几乎消失，表明通过水热处理成功还原了氧官能团。在798,970,1094,1635 cm^-1处观察到新的带，归因于SiO-H的弯曲振动，Si-OH，Si-O-Si和N-H的伸缩振动^[25]。FTIR光谱提供了成功还原GO和引入氨基硅胶的证据。

XRD测量用于研究产物的相和晶体结构。石墨片，GO，石墨烯，氨基硅胶和GES的XRD图谱如图3所示。

图3.氧化石墨烯，石墨烯，氨基硅胶，石墨片和GES的XRD图谱

石墨片氧化后，反射峰从2theta;=10.0°（d-间距=8.75 Aring;）处移动到较低的角度2theta;=26.6°（d-间距=3.35 Aring;），这表明石墨成功氧化^[26]。从GES的XRD图谱中，观察到在25°左右的石墨烯的特征宽峰，并且在通过水热法还原后没有观察到GO的典型衍射峰，这与GO在合成过程中被还原为石墨烯一致。根据氨基硅胶，石墨烯和GES的光谱，没有额外的衍射峰，可以得出结论，第三相不存在^[19]。

在图4A中，氨基硅胶凝胶的低倍SEM图像显示出不规则的形状和光滑的表面。在玛瑙研钵中混合并用乙醇超声波后，GES的低放大倍数SEM图像（图4B）表明氨基硅胶表面被石墨烯片包封。有证据表明石墨烯固定在氨基硅胶表面坚固，GES可以在MSPD提取过程中保持其结构。图4C中的GES的高放大率SEM图像显示出石墨烯的连续折叠和褶皱结构。

图4.氨基硅胶（A），rGO@二氧化硅（B）的低倍放大SEM图像和rGO二氧化硅（C）的高倍SEM图像

3.2 比较GES与其他四种吸附剂作为MSPD萃取吸附剂

在MSPD程序中，吸附剂和洗脱溶剂是主要影响因素，因为它们决定了萃取效率。在这项工作中，评估了六种吸附剂（GES，石墨烯，硅胶，C18二氧化硅，硅藻土，中性氧化铝）和不含任何吸附剂，四种聚甲氧基化黄酮类化合物用作目标化合物。分别测量体积为10mL的不同溶剂，例如甲醇，丙酮和二氯甲烷作为洗脱溶剂。因此，应用最典型的样品/分散剂比（1：4）^[27]进行初始试验。吸附剂和洗脱溶剂对峰面积的影响如图5所示。总之，当GES用于吸附剂，甲醇用于洗脱时，对于目标化合物实现了最佳提取。

图5.吸附剂和溶剂对提取峰面积（n=3）的影响，A.甲醇用作洗脱溶剂，B.丙酮用作洗脱溶剂，C.二氯甲烷用作洗脱溶剂

3.3 样品与分散体吸附剂的质量比

样品与分散体吸附剂的比例显着影响提取效率。在该工作中，为了确定样品与吸附剂的合适质量比，以1：1,1：2,1：3和1：4测试不同量的GES。结果表明，分析物的萃取峰面积随分散剂吸附剂的质量增加（最高1：2），且随着几乎保持不变的吸附剂比率峰面积进一步增加。为了减少分散剂的消耗，选择1：2的样品与分散剂吸附剂的比例。

3.4 洗脱溶剂的体积

采用GES作为分散剂，甲醇作为洗脱溶剂，比例为1：2，研究了洗脱溶剂体积对萃取效率的影响。在这种情况下，当洗脱溶剂的体积为5 mL时，所有目标化合物的峰面积最高。

3.5 方法验证

3.5.1 线性，精确度，检测限和量化

为了验证MSPD-UHPLC方法的性能，根据校准曲线的回归方程，相关系数，日内精度，日间精度，LOD和LOQ进行了评估。结果显示在表1中，相关系数均优于0.9999，这表明在测试范围内每个靶的浓度和峰面积之间具有良好的线性。通过分析含有四种目标化合物的标准混合物溶液，将精密度评估为日内和日间精确度，其中浓度水平大致等于样品浓度。对于日内和日间精确度，获得的RSD值小于1.48 %。LOD定义为产生S/N=3的最低浓度，其为0.004-0.012 g/mL。LOQ定义为产生S/N=10的最低浓度，其为0.01-0.04 g/mL。

表1.回归方程，日间精密度，日内精密度，LOD和四种黄酮类化合物的LOQ

a)在一天内对样品进行六次分

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