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完整细胞及微囊藻细胞壁多糖对氮、磷的吸附

摘要：微囊藻水华可在天然水体中延垂直和水平方向移动，这往往会导致微囊细胞周围营养环境的快速变化。为了评估当环境营养水平改变时，微囊捕获氮（N）和磷（P）的能力，我们研究了两种不同形式的微囊藻菌株，殖民地菌株XW01、单细胞菌株PCC 7806和小球藻类的小球藻在30分钟内及硝酸盐，铵盐和磷酸盐的不同浓度下吸附氮、磷。结果表明，XW01具有比PCC7806和小球藻强得多的吸附能力。作为细胞壁的主要成分，XW01多糖在不同的浓度下显示不同的氮、磷吸附量，它们的吸附能力随N或P浓度增大而上涨。与pH7.0比较，虽然XW01在硝酸盐中吸附略有下降，但XW01可以在碱性条件下（pH 9.0）吸附更多氨和磷酸。

关键词：微囊藻 蓝藻 吸附 胞外多糖 氮 磷

引言

蓝藻水华是世界各地的严重的环境问题（Chorus and Bartram 1999年; Jin et al .2005a）。微囊藻是最常见的水华形成菌属之一（Kondo et al. 2000; Vasconcelos 2006）。虽然富营养化被认为是蓝藻水华发生的一个关键原因（Jorgensen 2003; Jin et al. 2005a），但为什么微囊藻能成为优势种或者它们如何拥有生态优势的详细机制仍是未知数。

微囊藻菌落能迅速在水中垂直移动。它们可通过产生气体液泡以增加细胞浮力从而在水面上得到足够的光能量（Walsby 1994），并迅速通过积累碳水化合物以增加细胞密度以致下沉到丰富的无机营养底部。这样的垂直运动可以微囊藻让得到充分的能量和营养供应（Reynolds 2007）。在地表水中微囊藻水华也随风力水平运动，其速度大于10km/h。微囊藻菌落的移动可能会改变营养成分往往集中地被密集的细胞消耗的细胞周围的营养环境。当微囊藻被暴露于一个新的环境，应该是微囊藻赢得与其他营养物质浮游植物竞争从环境中积累营养物质的开始。

蓝藻有很强的从环境中吸收金属离子的能力（Gardea-Torresdey et al. 1998;Raungsomboona et al. 2006）。有研究表明，微囊藻在细胞壁上可以显著的结合钙，镁，铁和其他金属（Geng et al. 2007; Pradhan et al.2007）。显然，细胞壁的离子吸附能力对积累周围的营养物质是有利的。

氮（N）和磷（P）是微囊藻大量繁殖的最重要的两个营养素。氮磷营养物质大部分发表的研究都集中在不同形态和浓度的关系（Branco and Senna 1994; Kameyama et al.2002; Wan et al.2007;Ding et al.2010）。这些结果来自一段时间（至少几天）的观测；没有已发表的研究是关于当微囊藻细胞到了一个新的环境短时间内的营养吸收。在这项研究中我们在NP浓度不同的情况下用完整微囊藻细胞和细胞壁多糖吸附氮磷来评估微囊藻获取氮，磷营养物质的能力。

材料与方法

铜绿微囊藻XW01是从蓝藻水华分离出；单细胞菌株微囊藻PCC7806来自张教授的实验室（LCB-CNRS, Marseille, France）；蛋白核小球藻是从富营养化的池塘分离出的。所有菌株均在BG11培养基（Waterbury 2006）在28℃下由荧光灯提供60mu;mol质子连续照射。

为了制备N和P饥饿细胞，取30mL藻培养物在转速为7000times;g下离心10分钟，将沉淀用20 mL N- and P-free BG11培养基培养并通过再悬浮和离心洗涤3次。洗涤后的细胞转移到30mL N and P - free BG11培养基并培养5天。

细胞壁多糖的提取

微囊培养物的离心沉淀被再悬浮于10mL蒸馏水中。细胞通过重复冷冻（-20℃）破裂并在冰箱中解冻（4℃）三次。细胞壁碎片通过10000times;g的10分钟离心来收集。将沉淀物用5mL水洗涤两次，然后再悬浮于10mL水中，并保持在90℃约24小时，以提取多糖。

提取液以10000times;g离心10分钟以除去不溶性颗粒。上清液通过蛋白酶K酶解并用苯酚-氯仿处理以除去蛋白质。多糖用20ml乙醇沉淀，以10000times;g离心15分钟，并把多糖沉淀溶解于5mL水中。制备水溶性多糖的透明溶液，浓度为大约40mu;g mL^minus;1，浓度通过硫酸-酚比色法测定（Dubois et al. 1956）。

吸附方法

太湖平均N、P水平（中国东部微囊藻水华发生的富营养化严重的湖泊）2008年5月分别为3.07mg L^minus;1和83mg L^minus;1（由太湖流域管理局，水文局水资源公布）。我们为吸附试验建立了三个N和P的浓度水平：0.6，3.0和15mg L^minus;1的N（用NaNO₃ (NO₃^minus;-N) 或 NH₄Cl (NH₄ -N)配），16，80 和400mu;g L^minus;1 的P（用 Na₂HPO₄配）。所有溶液包含了0.30gL^-1 NaCl溶液来渗透平衡（自然的pH）。

测量细胞和多糖的吸附之前，进行空白对照（渗透管用2mL0.3gL^-1的NaCl）试验以验证没有具体的吸附是由渗透器引起的（隔断10 KD），在30分钟内达到渗透平衡。

为了测试完整细胞的吸附，2mL N和P饥饿细胞以7000times;g离心15分钟被收集，将该粒料洗涤（10mL），再悬浮（2mL）于0.30gL^-1的 NaCl溶液中并转移到渗透管里。然后，渗透管在25℃下温和搅拌30分钟浸没在30mL硝酸盐，氨或磷酸盐的渗透液中。渗透管被除去，并测定最后的渗透液中N、P的浓度。在渗透液浓度下降的基础上计算细胞吸附N、P的能力。所有试验一式三份进行。

为了测试细胞壁多糖的吸附，多糖溶液（约15 mu;g mL^minus;1）在对1％EDTA-NA2渗透后被分配到渗透管中（为多糖制备过程中消除重金属离子污染准备）和二次蒸馏水中（每次渗透至少2个小时）。将管放入浓度不同的N、P溶液中30分钟。和完整细胞对N、P的吸附测定方式一样。完整细胞和细胞壁多糖的吸附能力（AC）通过下式计算：

上式中 ：

C_i是N或P的初始浓度；

C_f是N或P的终浓度；

V₀为的渗透液的体积；

V_i是细胞悬液或多糖溶液在渗透管的体积；

W是叶绿素a或多糖的量。

完整的细胞中的多糖吸附理论百分比（R）以他们的吸附能力及在细胞中的含量为基础，计算如下：

上式中：P_c是完整的细胞中细胞壁多糖的量；

A_c是吸附能力（以上为测量），

Ta是完整细胞吸附的总量。

N、P浓度的测量

N和P浓度通过标准方法测定（SEPA 2002）如下（检测极限）：NO₃^minus;-N用紫外分光光度法（0.08 mg L^minus;1）；NH₄ -N由Nesslerization方法（0.025mgL^-1）;磷酸盐通过钼锑抗分光光度计法（0.01mgL^-1）。数据分析通过Microsoft Excel进行;P lt;0.05被认为有显著的统计学。

结果

三株藻对N的吸附

图一显示了三株藻在30分钟内对不同浓度的NO^3minus;-N 和 NH₄ -N的吸附。微囊藻XW01具有最高的吸附能力，两个微囊菌株比小球藻有更高吸附能力。当N浓度在最低水平0.6mg L^minus;1，微囊XW01吸附NO₃^minus;-N的量是微囊藻PCC7806的1.63倍和小球藻的3.71倍。当N浓度为15mgL^minus;1 ，微囊XW01吸附NO₃^minus;-N的量是微囊藻PCC7806的4.21倍和小球藻的1.32倍。

同样的，小球藻对NH₄ -N吸附为是微囊藻PCC7806的77.7％和微囊藻XW01的61.5％。值得关注的是微囊藻XW01比微囊藻PCC7806吸附这两种形式的氮显著高。

所有菌株显示在高浓度的溶液中有较高的吸附能力。对于微囊XW01，当N的浓度为3.0 和 15 mg L^minus;1时，NO₃^minus;-N的吸附量分别是浓度为0.6mg L^minus;1时的2.4和33.4倍，NH₄ -N的吸附量分别是浓度为0.6mg L^minus;1时的6.24和47.7倍。

图一 XW01、PCC7806和小球藻对NO₃^minus;-N和NH₄ -N的吸附

三株藻对P的吸附

三株藻对磷吸附能力也随磷浓度（图二）增加。小球藻和微囊藻PCC7806在不同磷浓度（无统计学差异）有类似的吸附能力；然而，微囊藻XW01有一个比另外两个有高得多的吸附能力。在P浓度为16, 80 和400 mu;g L^minus;1的溶液中，微囊藻XW01的吸附能力分别是微囊藻PCC7806的6.65, 4.77 和2.46倍。由此看出，微囊藻比单细胞株有较高的吸附磷的能力，尤其是在低浓度情况下。

图二 XW01、PCC7806和小球藻对PO₄^3--P的吸附量

上述数据表明，微囊XW01有比微囊藻PCC7806较高的吸附N、P的能力。殖民菌株通常含有较多的细胞壁多糖（Wu and Song 2008）。微囊XW01中的每毫克叶绿素a中的细胞壁多糖比微囊藻PCC7806中的多25.9%。因此，多糖有助于氮和磷的吸附是合理的假设。因此，我们测量细胞壁多糖的吸附能力。

细胞壁多糖对N、P的吸附

多糖吸附与浓度呈正相关（图三）。它不同于完整细胞，多糖比硝酸盐有较高的吸附氨的能力。当N的浓度为0.6、3.0 和 15 mg L^minus;1时，多糖对NH₄ -N吸附分别是吸附NO₃ ^-- N的3.36，1.66，1.72倍，这个结果可能与酸性细胞壁多糖的特性相关（Plude等，1991）。多糖对磷的吸附还随磷浓度的增加而增加（图四）。

图三 微囊藻XW01细胞壁多糖对N的吸附随N浓度变化

图四 微囊藻XW01细胞壁多糖对P的吸附随pH浓度变化

pH值对吸附N、P的影响

光合作用能引起水的pH值升高。在微囊出现的地表水，pH值经常是在pH为9.0。因此，我们研究了吸收pH值对微囊藻XW01的吸附能力的影响。

pH值明显影响微囊藻细胞XW01对N、P的影响。在pH9.0时，硝酸盐吸附pH小于7.0（N浓度0.6， 3.0和 1.5 mg L^minus;1分别小于10, 18 和 30 %）。然而，对氨和磷酸的吸附在pH9.0比在pH7.0高（图五）。特别是在pH为9.0时磷吸附为在中低浓度的pH7.0时的6.5倍的（16 mu;g L^minus;1 P），在P为400 mu;g L^minus;1时是2.18倍。

图五 不同pH值在不同的N浓度下对微囊藻XW01吸附N的影响

（不同字母代表显著差异，P lt;0.05）

讨论

发生水华的水体营养化水平通常适合各种浮游植物生长。虽然蓝藻水华常发生在富营养化水体中，但微囊藻在N和P处于较低的水平时仍占主导地位（(Bucka 1989），使他们不可避免地面临的与周围其他藻类竞争氮，磷营养元素。微囊藻比小球藻吸附更多的N和P，这可能就是为什么微囊超越了绿藻占主导地位的一个重要原因。

藻的细胞壁结构不同可能会导致不同的吸附能力。细胞壁多糖含有许多官能团为细胞吸附贡献了很多（Vijayaraghavan and Yun 2008; Kenney and Fein 2011; Sui et al. 2012）。微囊藻具有胶浆护套，其主要含有多糖，这为离子提供许多结合位点，并因此对N和P的吸附具有较高的能力。然而，绿藻有不同的细胞壁结构，其主要是纤维素。虽然小球藻细胞覆盖了一层酸性多糖胶质，但其量比蓝藻细胞壁多糖小得多（Rezanka and Sigler 2007）。

微囊藻XW01比单细胞微囊PCC780有更多的细胞壁多糖（Wang et al. 2011）。

微囊的酸性多糖含有多种聚阴离子官能团，如羧基，羟基，羰基，硫酸盐等等。

他们优先吸收阳离子（Nakagaea et al. 1987; Plude et al. 1991; Ruuml;ckert and Giani 200

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